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1、生物化學(xué)蛋白質(zhì)的分離、純化與表征CollegeofLifeScience1蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)2蛋白質(zhì)分子的大小與形狀3蛋白質(zhì)的膠體性質(zhì)與蛋白質(zhì)沉淀4蛋白質(zhì)分離純化的一般原則5*蛋白質(zhì)分離純化的方法6蛋白質(zhì)含量的測(cè)定與純度鑒定一、蛋白質(zhì)的酸堿性質(zhì)蛋白質(zhì)與氨基酸相似，也具有兩性電離的性質(zhì)。蛋白質(zhì)的多肽鏈含有末端氨基和羧基，一些側(cè)鏈上含有可解離的基團(tuán)，有的可以接受氫離子，有的可以電離出氫離子，因此蛋白質(zhì)具有酸堿兩性電離的性質(zhì)。它的兩性電離比氨基酸復(fù)雜。對(duì)某一蛋白質(zhì)而言，在某一pH下，當(dāng)它所帶正負(fù)電荷相等的時(shí)候，該溶液的pH就稱為該蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)。蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)的大小與蛋白質(zhì)
2、的氨基酸組成有關(guān)。二、蛋白質(zhì)的大小與形狀π:滲透壓R:氣體常數(shù)T：絕對(duì)溫度c:溶質(zhì)的濃度（g/m3）π/c對(duì)c作圖，在c趨近于零時(shí)得出Mr菲克第二定律擴(kuò)散不僅與蛋白質(zhì)的分子量有關(guān)，還與分子形狀有關(guān)由于濃度差異引起的溶質(zhì)分子的凈遷移成為平衡遷移或者遷移。菲克第一定律離心機(jī)類別低速離心機(jī)高速離心機(jī)超速離心機(jī)①離心力“F”當(dāng)一個(gè)粒子（生物大分子或細(xì)胞器）在高速旋轉(zhuǎn)下受到離心力作用時(shí)，此離心力“F”由下式定義，即：a-粒子旋轉(zhuǎn)的加速度，m-沉降粒子的有效質(zhì)量，ω-粒子旋轉(zhuǎn)的角速度，r-粒子的旋轉(zhuǎn)半徑(cm)。②相對(duì)離心力“RCF”相對(duì)離心力是指在離心場(chǎng)中，作用于顆粒的離心力
3、相當(dāng)于地球重力的倍數(shù)，單位是重力加速度“g”（980cm/sec2）,“RCF”相對(duì)離心力可用下式計(jì)算：RCF=1.119×10－5×(rpm)2r(rpm—revolutionsperminute每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)，r/min)③離心機(jī)轉(zhuǎn)速與離心力列線計(jì)算圖一般情況下，低速離心時(shí)常以轉(zhuǎn)速“rpm”來(lái)表示，高速離心時(shí)則以“g”表示。在報(bào)告超離心條件時(shí)，通常總是用地心引力的倍數(shù)“×g”代替每分鐘轉(zhuǎn)數(shù)“rpm”.轉(zhuǎn)速與離心力的換算:先在r標(biāo)尺上取已知的半徑和在rpm標(biāo)尺上取已知的離心機(jī)轉(zhuǎn)數(shù)，然后將這兩點(diǎn)間劃一條直線，與圖中RCF標(biāo)尺上的交叉點(diǎn)即為相應(yīng)的相對(duì)離心力數(shù)值。超離心法類
4、別1#密度梯度離心法（densitygradient）2*沉降速度法（sedimentationvelocity）3*沉降平衡法（sedimentationeguilibrium）密度梯度離心法#生物大分子及顆粒的沉降不僅決定于它的大小，而且也取決于它的密度。顆粒在具有密度梯度的介質(zhì)中離心時(shí)，質(zhì)量和密度大的顆粒沉降的快，并且每種蛋白質(zhì)顆粒沉降到與自身密度相等的介質(zhì)密度梯度時(shí)，即停止不前，最后各自在離心管中被分離成獨(dú)立的區(qū)帶。分成區(qū)帶的樣品可以在管底刺一個(gè)小孔逐滴放出，分步收集。常用的介質(zhì)有蔗糖、氯化銫等。蔗糖密度梯度蔗糖濃度離心管顆粒物質(zhì)或溶質(zhì)在超速離心場(chǎng)中的沉降速
5、率。用小寫斜體s表示。s=v/a，其中a為重力或離心加速度，v為沉降速度，即沉降系數(shù)為每單位離心力場(chǎng)的沉降速度。在較低速度（8,000-20,000r/min）的離心場(chǎng)中，離心開始時(shí)，分子顆粒發(fā)生沉降，由于沉降的結(jié)果造成濃度梯度。因而產(chǎn)生了擴(kuò)散作用，擴(kuò)散力的作用方向正與離心力相反，當(dāng)凈離心力與擴(kuò)散平衡時(shí)，在離心池內(nèi)從液面到池低形成一個(gè)由低到高的恒定濃度梯度。如果測(cè)得相關(guān)參數(shù)即可算出生物分子的分子量。離心力x1軸心液面離心軸擴(kuò)散力x2原理示意圖Vt：柱床“總?cè)莘e”，Vo：即存在于柱床內(nèi)凝膠顆粒外面空隙之間的水相容積Vi：即凝膠顆粒內(nèi)部所含水相的容積。Vg：凝膠本身的容
6、積；Vt＝Vo十Vi十Vg或Vt-Vo=Vi十Vg，凝膠床總體積分配系數(shù)（Kd）0＜Kd＜1，Ve在Vo與Vo十Vi之間變化Ve：為實(shí)際測(cè)得的洗脫容積，自樣品加入到組分最大濃度(峰)出現(xiàn)時(shí)所流出的容積Ve＝Vo十KdViVe=K1-K2lgMK1、K2為常數(shù)，Ve可用如下表達(dá)式代替，Ve-Vo（分離體積），Ve/Vo（相對(duì)保留體積），Ve/Vt（簡(jiǎn)化洗脫體積），Keff（相對(duì)洗脫體積）在不同型號(hào)凝膠上蛋白質(zhì)的選擇曲線的差異Ve與相對(duì)分子量的關(guān)系排阻范圍的選擇凝膠裝柱①將層析柱垂直裝載支架上，將下端輸液管夾緊；②向柱中加入約1/3體積的0.9％NaCl溶液；③將一細(xì)玻
7、棒伸入柱內(nèi)，靠近管內(nèi)壁，順著玻棒緩慢的向管內(nèi)加入混勻的凝膠溶液；④凝膠加至層析柱頂端約3cm時(shí)，打開柱下端輸液開關(guān)，使流速控制在0.25-0.5ml/cm2·nim。④連續(xù)而緩慢的加凝膠直到穩(wěn)定在離管口約5cm處。（防止空氣進(jìn)入凝膠床）柱層析系統(tǒng)的安裝凝膠層析中的分離行為藍(lán)葡聚糖（蘭色）、血紅蛋白（紅色）、鉻酸鉀(黃色)電泳蛋白質(zhì)的沉淀使蛋白質(zhì)從溶液中析出的現(xiàn)象稱為沉淀，方法有：1.鹽析：在蛋白質(zhì)的水溶液中，加入大量高濃度的強(qiáng)電解質(zhì)鹽如硫酸胺、氯化鈉、硫酸鈉等，使蛋白質(zhì)從溶液中析出，稱為蛋白質(zhì)的鹽析。而低濃度的鹽溶液加入蛋白質(zhì)溶液中，會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的溶解度增加，該
