葉綠體的分離和觀察.doc

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1、生命科學(xué)學(xué)院LifeScienceCollege細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告姓名：柳偉雄班級(jí)：2013級(jí)生科一班學(xué)號(hào)：201300140062同組者：曾瑋璠山東大學(xué)實(shí)驗(yàn)報(bào)告2015年5月10日姓名：柳偉雄系年級(jí)：生科一班2013級(jí)同組者：曾瑋璠科目：細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)題目：葉綠體的分離和觀察一、目的和要求1.通過植物細(xì)胞葉綠體的分離，了解細(xì)胞器分離的一般原理和方法2.觀察葉綠體的自發(fā)熒光和次生熒光，并熟悉熒光顯微鏡的使用方法二、原理將組織勻漿后懸浮在等滲介質(zhì)中進(jìn)行差速離心，是分離細(xì)胞器的常用方法。一個(gè)顆粒在離心場(chǎng)中的沉降

2、速率取決于顆粒的大小、形狀和密度，也同離心力以及懸浮介質(zhì)的黏度有關(guān)。在一給定的離心場(chǎng)中，同一時(shí)間內(nèi)，密度和大小不同的顆粒其沉降速率不同。一次增加離心力和離心時(shí)間，就能夠使非均一懸浮液中的顆粒按其大小、密度先后分批沉降在離心管底部，分批收集即可獲得各種亞細(xì)胞組分。葉綠體的分離應(yīng)在等身溶液（0.35mol/L氯化鈉或0.4mol/L蔗糖溶液）中進(jìn)行，以免滲透壓的改變使葉綠體損傷。將勻漿液在1000r/min的條件下離心2分鐘，以去除其中的組織殘?jiān)臀幢黄扑榈耐暾?xì)胞。然后，在3000r/min的條件下離心5分鐘

3、，即可獲得沉淀的葉綠體（混有部分細(xì)胞核）。分離過程最好在0℃—5℃的條件下進(jìn)行；如果在室溫下，要迅速分離和觀察。利用熒光顯微鏡對(duì)可發(fā)熒光的物質(zhì)進(jìn)行檢測(cè)時(shí)，將受到許多因素的影響，如溫度、光、淬滅劑等。因此在熒光觀察時(shí)應(yīng)抓緊時(shí)間，有必要時(shí)立即拍照。另外，在制作熒光顯微標(biāo)本時(shí)最好使用無熒光載玻片、蓋玻片和無熒光油。三、試劑和器材1.材料：新鮮菠菜2.試劑：（1）0.35mol/L氯化鈉溶液（2）0.01%吖啶橙（acridine?orange）3、器材：（1）主要設(shè)備：普通離心機(jī)，組織搗碎機(jī)，粗天平，熒光顯微鏡（

4、2）小型器材：500ml燒杯2個(gè)，250ml量筒1個(gè)，滴管20支，10ml刻度離心管20支，試管架5個(gè)，紗布若干，無熒光載玻片和蓋玻片各4片等四、實(shí)驗(yàn)步驟1.選取新鮮的嫩菠菜葉，洗凈擦干后去除葉梗脈，稱30g于150ml0.35mol/LNaCl溶液中，裝入組織搗碎機(jī)2.利用組織搗碎機(jī)低速（5000r/min）勻漿2—3分鐘3.將勻漿用6層紗布過濾于500ml燒杯中4.取濾液4ml在1000r/min下離心2min，棄去沉淀5.將上清液在3000r/min下離心5分鐘。棄去上清液，沉淀即為葉綠體（混有部分細(xì)

5、胞核）6.將沉淀用0.35mol/LNaCl溶液懸浮7.取上述葉綠體懸液一滴滴于載玻片上，加蓋玻片后即可在普通光鏡和熒光顯微鏡下觀察：①在普通光鏡下觀察；②在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的直接熒光；③在熒光顯微鏡下觀察葉綠體的間接熒光，取葉綠體懸液一滴滴在無熒光載玻片上，再滴加一滴0.01%吖啶橙熒光染料，加蓋玻片后即可在熒光顯微鏡下觀察。五、實(shí)驗(yàn)結(jié)果染色未染色1.在普通光鏡下，葉綠體呈現(xiàn)綠色的長橢圓形2.在熒光顯微鏡下，當(dāng)用綠光照射時(shí)，葉綠體發(fā)出紅色熒光；而用藍(lán)光照射時(shí)，同樣發(fā)出紅色熒光，相對(duì)綠光照射時(shí)的較暗。

6、而用吖啶橙染色后，葉綠體發(fā)出紅色熒光，而混雜在其中的細(xì)胞核細(xì)胞核發(fā)出綠色熒光