產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的分離.doc

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1、產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的分離摘要本設(shè)計(jì)為了研究堿性蛋白酶的性質(zhì)和它的相關(guān)作用，以及產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的獲得。設(shè)計(jì)內(nèi)容主要分為兩部分：產(chǎn)堿性蛋白酶菌株的篩選分為初選和復(fù)選；酶活力的測(cè)定；第一部分分為三個(gè)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)對(duì)菌株進(jìn)行富集、平板分離初篩、藥瓶發(fā)酵復(fù)篩；第二部分通過(guò)透明圈法初步進(jìn)行測(cè)定再在不同溫度不同PH下對(duì)酶性質(zhì)進(jìn)行測(cè)定，為堿性蛋白酶的研究和治療提供一定的理論及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。對(duì)堿性蛋白酶的應(yīng)用提供理論依據(jù)，及時(shí)的將理論轉(zhuǎn)化為生產(chǎn)力，提高工業(yè)生產(chǎn)的效益。關(guān)鍵詞：堿性蛋白酶；菌株；分離目錄第一部分：文獻(xiàn)綜述1．堿性蛋白酶31.1簡(jiǎn)介31.2堿性蛋白酶的理化性質(zhì)31.3酶的結(jié)構(gòu)和活性中心31.4堿性蛋白酶的

2、專一性42.堿性蛋白酶的分類42.1命名42.2類型43.堿性蛋白酶的應(yīng)用53.1堿性蛋白酶在食品中的應(yīng)用63.2堿性蛋白酶在洗滌用品中得到廣泛的應(yīng)用。63.3堿性蛋白酶在羊毛制品中的應(yīng)用63.4堿性蛋白酶在詞料工業(yè)中的應(yīng)用73.5堿性蛋白酶在其它領(lǐng)域的應(yīng)用84.產(chǎn)堿性蛋白酶菌株84.1生產(chǎn)菌株的種類84.2堿性蛋白酶工程菌的選擇85.堿性蛋白酶的研究前景9第二部分課程設(shè)計(jì)部分1.材料121.1土樣121.2培養(yǎng)基121.3主要實(shí)驗(yàn)儀器122.實(shí)驗(yàn)方法122.1菌株的分離方法122.2酶活力的測(cè)定133設(shè)計(jì)143.1產(chǎn)堿性蛋白酶的分離143.2.堿性蛋白酶活力的測(cè)定144總結(jié)155設(shè)計(jì)體會(huì)

3、15參考文獻(xiàn)16第一部分文獻(xiàn)綜述1．堿性蛋白酶1.1簡(jiǎn)介堿性蛋白酶(alkalineprotease)是一類適宜于在堿性條件下水解蛋白質(zhì)肽鍵的酶類,是一類非常重要的工業(yè)用酶,廣泛存在于動(dòng)、植物及微生物生物體中,在豬的胰臟中最早被發(fā)現(xiàn)。堿性蛋白酶在食品、洗滌及制革等行業(yè)中有著廣泛的用途。微生物蛋白酶均為胞外酶，它的處理技術(shù)相對(duì)簡(jiǎn)單、價(jià)格低、來(lái)源廣、菌體易培養(yǎng)、產(chǎn)量高、高產(chǎn)菌株選育簡(jiǎn)單快速、具有動(dòng)植物蛋白酶的所有特性，以與工業(yè)化生產(chǎn)。近幾年，堿性蛋白酶的研究有很大的進(jìn)展，取得了許多可喜的成果，及時(shí)的轉(zhuǎn)化成生產(chǎn)力，有很大的社會(huì)和生產(chǎn)效益。1.2堿性蛋白酶的理化性質(zhì)微生物的堿性蛋白酶的活性作用范圍

4、在PH值7-11之間，在酪氨酸中最適范圍為9-11之間，它可以水解肽鍵、酰胺鍵、醚鍵以及轉(zhuǎn)酯、轉(zhuǎn)肽等[1]。多數(shù)微生物產(chǎn)生的堿性蛋白酶耐熱性差，我國(guó)生產(chǎn)的幾種堿性蛋白酶耐熱溫度均在60℃以下。1.3酶的結(jié)構(gòu)和活性中心堿性蛋白酶的分子量一般在2.0-3.4萬(wàn)之間，等電點(diǎn)多為8.0-9.0，能作用于多數(shù)肽鏈，水解肽鍵生成二肽類物質(zhì)。其除酶本身的氨基酸殘基外,不具有特定的活性基團(tuán),因此,一些金屬離子(Fe2+,Mn2+,Mg2+,Zn2+等)對(duì)酶有激活作用。堿性蛋白酶屬絲氨酸蛋白酶,具有蛋白質(zhì)的基礎(chǔ)生化性質(zhì),一些生化物質(zhì)均能引起其變性失活,一些天然植物中也有蛋白酶抑制劑[2]。1.4堿性蛋白酶的

5、專一性堿性蛋白酶具有底物專一性,當(dāng)它與底物結(jié)合時(shí),依靠物理引力的作用,首先形成非共價(jià)的酶-底物復(fù)合物,接著絲氨酸輕基攻擊底物,產(chǎn)生四面體中間產(chǎn)物,隨后中間產(chǎn)物破裂,形成酶-產(chǎn)物復(fù)合物堿性蛋白酶的專一性強(qiáng)烈地受到切開位點(diǎn)兩側(cè)氣基酸殘基,尤其是第1和第4位氨基酸殘基的影響,較之血紅蛋白或牛血清蛋白,它更容易酶解酪蛋白[3]。可將堿性蛋白酶分為四種類型,依據(jù)其對(duì)切開位點(diǎn)基側(cè)氨基酸殘基的專一性[4]:—、對(duì)如精氨酸、賴氨酸等堿性氨基酸殘基具有專一性,該類酶與胰蛋白酶相似;二、如枯草桿菌堿性蛋白酶等,該類酶主要表現(xiàn)為對(duì)疏水性氨基酸殘基或芳香族具有有較強(qiáng)的專一性;三、如溶解細(xì)菌細(xì)胞壁的蛋白酶,該類蛋白

6、酶表現(xiàn)出對(duì)小分子脂肪族氨基酸殘基具有專一性;四、如葡萄球菌堿性蛋白酶,該類酶對(duì)酸性氨基酸殘基存在專一性。2.堿性蛋白酶的分類2.1命名堿性蛋白酶一般按照其所產(chǎn)菌株的名稱進(jìn)行命名,如丹麥諾維(Novo)公司的卡斯柏格枯草桿菌堿性蛋白酶(Subtilisincarlsberg)是卡斯伯格枯草芽孢桿菌生產(chǎn)的,堿性蛋白酶SubtilisinNovo是由另一株枯草芽孢桿菌Novo生產(chǎn)的,Nagase公司將枯草桿菌N所產(chǎn)的堿性蛋白酶取名SubtilisinBPN[5]。2.2類型產(chǎn)堿性蛋白酶的微生物從生態(tài)上可以分成兩類:一類是適于在中性pH條件下生長(zhǎng)并產(chǎn)酶的細(xì)菌,如枯草芽孢桿菌、短小芽孢桿菌、地衣芽孢

7、桿菌等;另一類是只在pH8-10的環(huán)境中生長(zhǎng)和產(chǎn)酶的嗜堿微生物。堿性蛋白酶大致分為兩種類型[6]:A型,由短小芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌生產(chǎn),其性質(zhì)和結(jié)構(gòu)與枯草芽孢桿菌喊性蛋白酶一致,這類菌株只產(chǎn)堿性蛋白酶;B型,由枯草芽孢桿菌淀粉糖化變種或枯草桿菌NRRLB3411產(chǎn)生,與BPN或Novo枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶的性質(zhì)和結(jié)構(gòu)一致,這類菌株既產(chǎn)堿性蛋白酶,又產(chǎn)中性蛋白酶。A、B兩型堿性蛋白酶在免疫學(xué)分析上沒有交叉反應(yīng),抗枯草桿