酶活力及其動力學(xué)常數(shù)的測定課件.ppt

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1、第九章酶活力及其動力學(xué)常數(shù)的測定酶是具有催化活性的蛋白質(zhì)酶學(xué)研究是現(xiàn)代分子生物學(xué)不可缺少的內(nèi)容。酶學(xué)研究的意義表現(xiàn)在①研究酶結(jié)構(gòu)和功能的關(guān)系，②分析酶的改變和疾病的關(guān)系③研究酶在發(fā)育及分化中的作用，④酶標(biāo)已成為現(xiàn)代分子生物學(xué)研究常用的工具⑤由于酶是其基因表達(dá)的產(chǎn)物⑥對酶工業(yè)的指導(dǎo)作用第一節(jié)基本概念一、酶活力指酶的催化活性。一般用國際單位表示。第五屆國際生化會議推薦：在一定條件(溫度和pH)下，1分鐘轉(zhuǎn)化lμmol底物所需的酶量為一個(gè)酶單位(1U)二、酶的比活力指每毫克蛋白中含有的酶活力單位數(shù)，用IU(U)/mg表示

2、。酶的比活力是酶濃度和酶質(zhì)量的衡量標(biāo)準(zhǔn)三、酶的轉(zhuǎn)換常數(shù)①分子活性：每摩爾酶分子、每分鐘轉(zhuǎn)換底物的摩爾數(shù)②催化中心活性：每摩爾活性亞基或催化中心每分鐘轉(zhuǎn)換底物的摩爾數(shù)四、KmKm是酶活性部位的一半被底物占據(jù)或酶反應(yīng)達(dá)到最大反應(yīng)速度一半時(shí)所需要的底物濃度，是一定溫度下酶的特征常數(shù)，又稱米氏常數(shù)。同一酶的不同底物有不同的Km。1/Km表示酶底親和常數(shù)，1/Km愈大，則親和力愈大五、V及VmV是反應(yīng)速度。指單位時(shí)間內(nèi)(如1分鐘)每毫克酶蛋白轉(zhuǎn)換底物的μmol數(shù)Vm表示在一定酶濃度和反應(yīng)條件下的最大反應(yīng)速度，是底物濃度足夠大

3、時(shí)，酶反應(yīng)速度趨向的極限值影響因素包括有酶濃度、底物濃度、pH、溫度、抑制劑、激活劑等。※研究一種因素的影響時(shí)，其余各因素均恒定。第二節(jié)酶活力的測定方法一、底物濃度對反應(yīng)速度的影響單底物、單產(chǎn)物反應(yīng)酶促反應(yīng)速度一般在規(guī)定的反應(yīng)條件下，用單位時(shí)間內(nèi)底物的消耗量和產(chǎn)物的生成量來表示反應(yīng)速度取其初速度，即底物的消耗量很?。ㄒ话阍?﹪以內(nèi)）時(shí)的反應(yīng)速度底物濃度遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于酶濃度研究前提在其他因素不變的情況下，底物濃度對反應(yīng)速度的影響呈矩形雙曲線關(guān)系。當(dāng)?shù)孜餄舛容^低時(shí)反應(yīng)速度與底物濃度成正比；反應(yīng)為一級反應(yīng)。[S]VVmax目錄

4、隨著底物濃度的增高反應(yīng)速度不再成正比例加速；反應(yīng)為混合級反應(yīng)。[S]VVmax目錄當(dāng)?shù)孜餄舛雀哌_(dá)一定程度反應(yīng)速度不再增加，達(dá)最大速度；反應(yīng)為零級反應(yīng)[S]VVmax目錄（一）米－曼氏方程式中間產(chǎn)物酶促反應(yīng)模式——中間產(chǎn)物學(xué)說E+Sk1k2k3ESE+P※1913年Michaelis和Menten提出反應(yīng)速度與底物濃度關(guān)系的數(shù)學(xué)方程式，即米－曼氏方程式，簡稱米氏方程式(Michaelisequation)。[S]：底物濃度V：不同[S]時(shí)的反應(yīng)速度Vmax：最大反應(yīng)速度(maximumvelocity)Ｋm：米氏常數(shù)

5、(Michaelisconstant)ＶVmax[S]Km+[S]＝──（二）Km與Vmax的意義Km值①Km等于酶促反應(yīng)速度為最大反應(yīng)速度一半時(shí)的底物濃度。②意義：a)Km是酶的特征性常數(shù)之一；b)Km可近似表示酶對底物的親和力；c)同一酶對于不同底物有不同的Km值。Vmax定義：Vm是酶完全被底物飽和時(shí)的反應(yīng)速度，與酶濃度成正比。（三）Ｋm值與Ｖmax值的測定1.雙倒數(shù)作圖法(doublereciprocalplot)，又稱為林-貝氏(Lineweaver-Burk)作圖法Vmax[S]Km+[S]V=兩邊同取

6、倒數(shù)二、酶濃度對反應(yīng)速度的影響當(dāng)[S]＞＞[E]，酶可被底物飽和的情況下，反應(yīng)速度與酶濃度成正比。關(guān)系式為：V=K3[E]0V[E]當(dāng)[S]>>[E]時(shí)，Vmax=k3[E]酶濃度對反應(yīng)速度的影響雙重影響溫度升高，酶促反應(yīng)速度升高；由于酶的本質(zhì)是蛋白質(zhì)，溫度升高，可引起酶的變性，從而反應(yīng)速度降低。三、溫度對反應(yīng)速度的影響最適溫度(optimumtemperature)：酶促反應(yīng)速度最快時(shí)的環(huán)境溫度。*低溫的應(yīng)用酶活性0.51.02.01.50102030405060溫度oC溫度對淀粉酶活性的影響四、pH對反應(yīng)速度的

7、影響最適pH(optimumpH)：酶催化活性最大時(shí)的環(huán)境pH。0酶活性pHpH對某些酶活性的影響胃蛋白酶淀粉酶膽堿酯酶246810二、酶活力的測定方法(一)總則①有可被檢測且能反映酶反應(yīng)進(jìn)行程度的信號物②底物對酶遠(yuǎn)遠(yuǎn)過量(通常底物濃度為Km的3～l0倍)③適宜的反應(yīng)溫度④最適pH反應(yīng)體系⑤被測的酶量適當(dāng)(二)酶的測活方法1．靜態(tài)法：在一定條件下將酶和底物作用一定時(shí)間后終止反應(yīng)，然后直接或間接地檢測底物的減少(或產(chǎn)物的增加)量，從而計(jì)算出酶的活力此法測活的關(guān)鍵步驟是反應(yīng)多長時(shí)間后終止反應(yīng)為解決這一問題，首先應(yīng)在較高

8、酶濃度下啟動反應(yīng)(曲線3)，于不同的反應(yīng)時(shí)間終止反應(yīng)，然后作出產(chǎn)物濃度一時(shí)間曲線找出產(chǎn)物隨時(shí)間線性增加的最長時(shí)間t。在正式測活中，選用低于此酶量的樣品，反應(yīng)到t。(或小于t。)時(shí)終止反應(yīng)即可得到正確的酶活性2．半動態(tài)法于不同時(shí)間分別從反應(yīng)體系中取出一定量的樣品，迅速置于反應(yīng)終止液中，然后通過檢測并計(jì)算反應(yīng)后不同時(shí)間樣品中的底物減少量(或產(chǎn)物增加量)，從而計(jì)算