《酶活力的測定》PPT課件.ppt

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1、第四章酶活力的測定第四章酶活力的測定第一節(jié)酶的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)(略)第二節(jié)酶活力測定方法第二節(jié)酶活力測定方法一、酶活力二、酶活力的測定一、酶活力酶活力是指酶催化某一化學(xué)反應(yīng)的能力，酶活力的大小可以用在一定條件下所催化的某一化學(xué)反應(yīng)的反應(yīng)速率來表示，兩者呈線性關(guān)系。酶反應(yīng)速率越大，酶活力越高，反之越低。酶催化的反應(yīng)速率可用單位時(shí)間內(nèi)底物的減少量或產(chǎn)物的增加量來表示。在實(shí)際酶活性測定中一般以測定產(chǎn)物的增加量為準(zhǔn)。酶活力的測定就是測定酶促反應(yīng)的初速率。1.概念一、酶活力酶活力的大小即酶含量的多少，用酶活力單位表示,即酶單位(activityunit，U)。酶單位的定義：在一定條件

2、下，一定時(shí)間內(nèi)將一定量的底物轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物所需的酶量。這樣酶的含量就可以用每克酶制劑或每毫升酶制劑含有多少酶單位來表示，即“U/g”或“U/mL”。世界各地實(shí)際應(yīng)用的酶活力單位的定義各不相同。同一種酶往往有幾種不同的單位。例如，1IU＝lμmol/min；1Kat=1mol/s2.酶活力單位一、酶活力酶活力的測定要在最適條件下進(jìn)行，即最適溫度、最適pH、最適底物濃度和最適緩沖液離子強(qiáng)度等，只有在最適條件下測定才能真實(shí)反映酶活力大小。測定酶活力大小時(shí)，通常要求底物濃度足夠大，測定底物濃度的變化在起始濃度的5％以內(nèi)的速率，這樣可以保證所測定的速率是最初速率。此結(jié)果能比較可靠地

3、反映酶的含量。一、酶活力3.酶的比活力酶的比活力代表酶的純度，通常用下式表示：酶比活力=[酶活力單位數(shù)(U)/蛋白質(zhì)量(mg)]有時(shí)也采用每克(g)酶制劑或每毫升(mL)酶制劑含有多少個(gè)活力單位來表示。比活力的大小可用來比較每單位質(zhì)量蛋白質(zhì)的催化能力。比活力是酶學(xué)研究及生產(chǎn)中經(jīng)常使用的指標(biāo)。二、酶活力的測定1.酶活力的測定步驟要求酶活力的測定方法：快速、簡便、準(zhǔn)確。酶活力測定均包括兩個(gè)階段：首先要在一定的條件下，酶與其作用底物反應(yīng)一段時(shí)間，然后再測定反應(yīng)液中底物或產(chǎn)物變化的量。二、酶活力的測定酶活力的測定步驟①底物②反應(yīng)條件③反應(yīng)時(shí)間④底物或產(chǎn)物變化量選擇底物配制底物

4、溶液確定酶促反應(yīng)條件：pH、溫度等準(zhǔn)確計(jì)時(shí)并終止反應(yīng)運(yùn)用各種檢測技術(shù)，快速、簡便、準(zhǔn)確的測定變化量二、酶活力的測定①底物：根據(jù)酶的專一性，選擇適宜的底物，并配制成一定濃度的底物溶液。要求所使用的底物均勻一致，達(dá)到一定的純度。有些底物溶液要求新鮮配制，有些則可預(yù)先配制后置冰箱保存?zhèn)溆?。②反?yīng)條件：據(jù)資料或試驗(yàn)結(jié)果，確定酶促反應(yīng)的溫度、pH等條件。溫度可選在室溫(25℃)、體溫(37℃)、酶促反應(yīng)最適溫度或其他選用的溫度，一般在恒溫裝置內(nèi)進(jìn)行。pH應(yīng)是酶促反應(yīng)的最適pH，采用一定濃度和一定pH的緩沖溶液來保持。反應(yīng)條件一經(jīng)確定，在反應(yīng)過程中應(yīng)盡量保持恒定不變。有些酶促反應(yīng)

5、要求激活劑等其他條件，應(yīng)適量添加。二、酶活力的測定④底物或產(chǎn)物的變化量：反應(yīng)到一定時(shí)間，取出適量的反應(yīng)液，運(yùn)用各種生化檢測技術(shù)，測定產(chǎn)物增加量或底物的減少量。為了準(zhǔn)確地反應(yīng)酶促反應(yīng)的結(jié)果，應(yīng)盡量采用快速、簡便、準(zhǔn)確的方法測出結(jié)果。③反應(yīng)時(shí)間：在一定條件下，將一定量的酶液與底物溶液混合均勻，適時(shí)記下反應(yīng)開始的時(shí)間。反應(yīng)到一定時(shí)間及時(shí)終止反應(yīng)。終止酶促反應(yīng)的方法要根據(jù)酶的特性、反應(yīng)底物或產(chǎn)物的性質(zhì)以及檢測方法等加以選擇。常用：加熱、添加酶變性劑、加入酸液或堿液、冰浴等。二、酶活力的測定2.酶活力的測定方法測定反應(yīng)液中物質(zhì)的變化量，可采用光學(xué)檢測法、化學(xué)檢測法等生化檢測技術(shù)

6、。一種酶可能有多種測定方法，要根據(jù)實(shí)際情況選用。二、酶活力的測定1.分光光度法2.熒光法酶活力的測定方法3.同位素測定法4.電化學(xué)方法5.其他方法二、酶活力的測定1.分光光度法分光光度法主要利用底物和產(chǎn)物在紫外光或可見光部分的光吸收度的不同，選擇一適當(dāng)?shù)牟ㄩL，測定反應(yīng)過程中反應(yīng)進(jìn)行的情況。其優(yōu)點(diǎn)是簡便、節(jié)省時(shí)間和樣品，可檢測到nmol/L水平的變化。該方法可以連續(xù)地讀出反應(yīng)過程中光吸收的變化，已成為酶活力測定中一種重要的方法之一。幾乎所有的氧化還原酶都可以用此法測定。二、酶活力的測定由于分光光度法有其獨(dú)特的優(yōu)點(diǎn)，因此可以把一些原來沒有光吸收變化的酶反應(yīng)通過與一些能引起

7、光吸收變化的酶反應(yīng)偶聯(lián)，使第一個(gè)酶反應(yīng)的產(chǎn)物轉(zhuǎn)變成為第二個(gè)酶的具有光吸收變化的產(chǎn)物來進(jìn)行測量。這種方法稱為酶偶聯(lián)測定法。二、酶活力的測定2.熒光法熒光法主要是根據(jù)底物或產(chǎn)物熒光性質(zhì)的差別來進(jìn)行測定。由于熒光方法的靈敏度往往比分光光度法要高若干個(gè)數(shù)量級，而且熒光強(qiáng)度和激光的光源有關(guān)，因此在酶學(xué)研究中越來越多地被采用，特別是一些快速反應(yīng)的測定方法。該法缺點(diǎn)：易受其他物質(zhì)干擾，有些物質(zhì)如蛋白質(zhì)能吸收和發(fā)射熒光，這種干擾在紫外區(qū)尤為顯著，故用熒光法測定酶活力時(shí)，應(yīng)盡可能選擇可見光范圍的熒光進(jìn)行測定。二、酶活力的測定3.同位素測定法用帶有放射性同位素標(biāo)記的底物