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《糖化酶活力測(cè)定.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、實(shí)驗(yàn)三糖化酶活力的測(cè)定指導(dǎo)老師：孫運(yùn)軍研究生：趙淵徐妙一、目的和內(nèi)容目的：學(xué)習(xí)測(cè)定糖化酶活力的原理并掌握測(cè)定糖化酶活力的方法內(nèi)容：１.學(xué)習(xí)糖化酶活力的原理．２.測(cè)定并計(jì)算糖化酶活力．二、糖化酶簡(jiǎn)介以及其活性的測(cè)定原理①糖化酶的應(yīng)用及生產(chǎn)②糖化酶的催化原理③酶活測(cè)定方法①糖化酶的應(yīng)用與生產(chǎn)糖化酶，全名葡萄糖淀粉酶（GlucoamylaseEC.3.2.1.3），又名淀粉葡萄糖苷（Amyloglucosidase）或γ-淀粉酶（γ-amylase），是一種含有甘露糖、葡萄糖、半乳糖和糖醛酸的糖蛋白，分子量在60～1000kDa之間。因發(fā)酵工業(yè)中大量用作淀粉糖化劑，習(xí)慣上簡(jiǎn)稱糖
2、化酶。糖化酶在工業(yè)生產(chǎn)中的應(yīng)用：糖化酶是淀粉糖化發(fā)酵生產(chǎn)酒精和葡萄糖漿的主要酶類。特別是釀酒酵母利用淀粉原料發(fā)酵時(shí)，淀粉液化后的糖化作用是必不可少的工序，因?yàn)榇蠖鄶?shù)釀酒酵母只能利用可發(fā)酵的糖進(jìn)行酒精發(fā)酵。糖化酶不僅用于酒類、酒精生產(chǎn)和葡萄糖漿的制取，還廣泛地用于抗生素、氨基酸、有機(jī)酸的生產(chǎn)。糖化酶是我國(guó)產(chǎn)量最大、應(yīng)用最廣的酶制劑之一。目前，工業(yè)中廣泛使用黑曲霉(Aspergillusniger)、泡盛曲霉(Aspergillusawamori)、米根霉(Rhizopusoryzae)和臭曲霉(Aspergillusfoetidus)為生產(chǎn)菌株來發(fā)酵生產(chǎn)糖化酶。今天的實(shí)驗(yàn)用
3、酶就是利用黑曲霉變異菌株進(jìn)行液體深層通風(fēng)發(fā)酵后提取獲得。②糖化酶的作用機(jī)制糖化酶是由一系列微生物分泌的具有外切酶活性的胞外酶。糖化酶的主要作用是從淀粉、糊精、糖原等碳鏈上的非還原性末端（整個(gè)碳鏈只有一個(gè)還原端，與之相對(duì)的都是非還原端）依次水解a-1,4糖苷鍵,切下一個(gè)個(gè)葡萄糖單元，并像β-淀粉酶一樣,使水解下來的葡萄糖發(fā)生構(gòu)型變化，形成β-D-葡萄糖。對(duì)于支鏈淀粉，當(dāng)遇到分支點(diǎn)時(shí)，它也可以水解a-1,6糖苷鍵，由此將支鏈淀粉全部水解成葡萄糖。糖化酶也能微弱水解a-1,3連接的碳鏈，但水解a-1,4糖苷鍵的速度最快，它一般都能將淀粉百分之百地水解生成葡萄糖。還原端③酶活測(cè)定
4、方法測(cè)定糖化酶的方法有次碘酸鈉法、蘭–愛農(nóng)法（ＳＰ法）、Schoorl法（ＤＵ法）和對(duì)硝基苯酚葡萄糖法（ＮＰＧ法）、3,5-二硝基水楊酸(DNS)等方法。本試驗(yàn)測(cè)定糖化酶活力采用次碘酸鈉法。糖化酶以可溶性淀粉為底物在一定條件下（pH范圍是4～6,溫度范圍是40～60℃）進(jìn)行反應(yīng)，生成的葡萄糖用次碘酸鈉法定量測(cè)定。以單位時(shí)間內(nèi)分解α–１，４糖苷鍵生成葡萄糖所需的酶量為酶的活力單位。次碘酸鈉法：碘與NaOH作用能生成NaIO，而葡萄糖能定量地(1:1)被NaIO氧化在酸性條件下，未與C6H12O6作用的NaIO可轉(zhuǎn)變成I2析出,因此只要用Na2S2O3標(biāo)準(zhǔn)溶液滴定析出的I2，
5、便可計(jì)算出未參與反應(yīng)的NaIO，由此推導(dǎo)出糖化酶催化所產(chǎn)生的C6H12O6的含量。1.I2與NaOH作用:I2+2NaOH=NaIO+NaI+H2O2.C6H12O6與NaIO定量作用:C6H12O6+NaIO=C6H12O7+NaI3.C6H12O6反應(yīng)完后,剩余的NaIO在堿性條件下發(fā)生歧化反應(yīng):3NaIO=NaIO3+2NaI4.歧化產(chǎn)物在酸性條件下進(jìn)一步作用生成I2:NaIO3+5NaI+6H2SO4=3I2+6Na2SO4+3H2O5.析出的I2可用標(biāo)準(zhǔn)Na2S2O3溶液滴定之:I2+2Na2S2O3=Na2S4O6+2NaI注釋：在這一系列的反應(yīng)中，1mol葡
6、萄糖與1molNaIO作用，而1molI2產(chǎn)生1molNaIO，因此，1mol葡萄糖與1molI2相當(dāng)。只要得出對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組所消耗的硫代硫酸鈉體積，兩者相減就可以得出與葡萄糖反應(yīng)的那部分次碘酸鈉的量，從而可以確定酶解生成的葡萄糖的量，從而計(jì)算出酶活。對(duì)照組實(shí)驗(yàn)組三、試劑與器材1.糖化酶試劑；2.微量滴定管、滴定臺(tái)、試劑瓶、試管、三角瓶、pH計(jì)、電子天平；3.試劑2%可溶性淀粉溶液；pH4.6、0.1mol/L的醋酸緩沖液；0.1mol/L碘液；0.1mol/L氫氧化鈉溶液；2mol/L硫酸溶液；0.1N硫代硫酸鈉溶液；0.5%淀粉指示劑。四、操作步驟1.取7個(gè)帶塞的試管
7、（其中3個(gè)測(cè)今年批次的酶活、另外3個(gè)測(cè)去年批次的酶活、1個(gè)作空白對(duì)照），分別吸取2%可溶性淀粉液5ml，加入pH4.6醋酸緩沖液2.5ml，混勻后于40℃水浴中預(yù)熱10min。2.加入酶液0.5ml（空白對(duì)照組以煮沸失活的酶液代替）于40℃，反應(yīng)10min；反應(yīng)結(jié)束時(shí)，立即于沸水浴加熱5min使酶失活(此時(shí)應(yīng)將試管的塞子打開）。3.取上述反應(yīng)液5ml于三角瓶中，加入0.1N碘液5ml，緩慢加入0.1mol/LNaOH溶液5ml(注意:加堿速度不能過快,否則過量NaIO來不及氧化C6H12O6而歧化為不與C6H12O6反應(yīng)的Na
