植物組織或器官中丙二醛含量測定.ppt

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1、植物組織或器官中丙二醛含量的測定制作人：劉新單位：生命科學(xué)學(xué)院植物生理學(xué)教研室一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?.掌握植物體內(nèi)丙二醛含量測定的原理及方法。2.了解丙二醛積累對(duì)細(xì)胞的傷害二、實(shí)驗(yàn)原理：硫代巴比妥酸TBA丙二醛3,5,5′-三甲基惡唑2,4-二酮（三甲川）逆境膜脂的過氧化作用丙二醛酸性粉紅色三、實(shí)驗(yàn)材料：受干旱、高溫、低溫等逆境脅迫的植物葉片或衰老的植物器官（以正常條件下的作為對(duì)照）：實(shí)驗(yàn)儀器：紫外可見分光光度計(jì)離心機(jī)四、實(shí)驗(yàn)步驟：1MDA的提取稱2g葉片，加入5ml磷酸緩沖液（50mmol，pH值為7.8）及少量石英砂，于冰浴

2、中研磨提取，勻漿液以12000g離心力作用下（4度）離心10min，其上清液即為MDA提取液。2MDA的測定取1mlMDA提取液，加3ml27％三氯乙酸和1ml2%TBA?；旌鸵涸?5度水浴中保溫30min后，立即置于冰浴中冷卻，然后離心10min，于波長532nm和600nm下測定OD值。五、結(jié)果計(jì)算以測得的OD532減去OD600的非特異吸收值，按155mmol-1cm-1消光系數(shù)計(jì)算MDA含量。分別計(jì)算衰老和對(duì)照組的值。MDA濃度(μmol/L)=6.45(D532-D600)-0.56D450MDA含量(μmol/

3、gFW)＝D450、D532、D600分別代表450nm、532nm和600nm波長下的光密度值。六、注意事項(xiàng)：0.1-0.5％的三氯乙酸對(duì)MDA—TBA反應(yīng)較合適，若高于此濃度，其反應(yīng)液的非專一性吸收偏高；MDA-TBA顯色反應(yīng)的加熱時(shí)間，最好控制沸水浴10-15min之間。時(shí)間太短或太長均會(huì)引起532nm下的光吸收值下降；如待測液渾濁，可適當(dāng)增加離心力及時(shí)間，最好使用低溫離心機(jī)離心。低濃度的鐵離子能增強(qiáng)MDA與TBA的顯色反應(yīng)，當(dāng)植物組織中鐵離子濃度過低時(shí)應(yīng)補(bǔ)充Fe3+（最終濃度為0.5nmol·L-1）可溶性糖與TB

4、A顯色反應(yīng)的產(chǎn)物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），當(dāng)植物處于干旱、高溫、低溫等逆境時(shí)可溶性糖含量會(huì)增高，必要時(shí)要排除可溶性糖的干擾。思考題：1.通過丙二醛含量測定能夠解決什么理論和實(shí)際問題？2.說明膜脂過氧化作用的對(duì)植物的影響。3.TBA為什么要溶解在三氯乙酸中？4.為什么要測定反應(yīng)液在600nm下的吸光度？5.丙二醛反應(yīng)液為什么加熱時(shí)間過長會(huì)影響測定結(jié)果？6.如果可溶性糖含量影響丙二醛含量的測定，你有什么辦法消除其影響？7.正常植物與衰老時(shí)相比丙二醛含量有什么變化，分析其原因。