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1、動物肝組織中丙二醛含量測定方法的改進(jìn)【摘要】目的初步探討糖類物質(zhì)對肝組織中丙二醛（MDA）含量測定的干擾并改進(jìn)測定方法。方法該實(shí)驗(yàn)以含糖量不同的小鼠肝勻漿作為實(shí)驗(yàn)材料，通過葡萄糖在450nm和532nm處吸光度值的正相關(guān)關(guān)系建立直線回歸方程，校正MDA在532nm處的吸光度值。計算出樣品中MDA含量。結(jié)果肝組織中糖類物質(zhì)會干擾MDA含量的測定，尤其是當(dāng)樣品中糖量含量間差異較大時，糖的干擾可能導(dǎo)致對機(jī)體受損程度的錯誤評判。結(jié)論改進(jìn)后的方法更為科學(xué)、準(zhǔn)確，可應(yīng)用于動物肝組織丙二醛含量的測定?！娟P(guān)鍵詞】丙二醛；靈芝多糖；葡萄糖；直線回歸法丙二醛（Malomdi
2、aldehvde，MDA）是機(jī)體內(nèi)的氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，形成的脂質(zhì)過氧化物，測試MDA的量可反映機(jī)體內(nèi)脂質(zhì)過氧化的程度，間接地反映出細(xì)胞損傷的程度［1］。傳統(tǒng)的測定方法是利用過氧化降解產(chǎn)物中的丙二醛與硫代巴比妥酸（TBA）在高溫和酸性條件下縮合，形成的紅色產(chǎn)物三甲川（3，5，5-三甲基惡唑2，4-二酮）于532nm處有最大吸收峰來進(jìn)行測定的。這種方式常常受到多種物質(zhì)不同程度的干擾［2］。其中最主要的干擾因素是組織內(nèi)的可溶性糖。動物肝組織中含有大量的肝糖原，在測定時降解的葡萄糖會干擾測定。而探討動物組織中糖類物質(zhì)對MDA測定的干擾及消除方
3、法還未見報道。本研究以含糖量不同的小鼠肝勻漿作為實(shí)驗(yàn)材料，初步探討了葡萄糖對肝組織中MDA含量的測定的干擾并改進(jìn)了測定方法。 1材料 1.1動物清潔級昆明種雄性小鼠，18～20g，由湖北省疾病預(yù)防控制中心實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供。動物飼養(yǎng)室溫度為22～25℃，濕度為65%～80%?！ ?.2試劑丙二醛（MDA）測定試劑盒，購于南京建成工程研究所。其它化學(xué)試劑均為分析醇。 1.3儀器752型紫外光柵分光光度計（上海精密科學(xué)儀器有限公司）；飛鴿牌TGL-16C離心機(jī)（上海安亭科學(xué)儀器廠）；解剖剪?！ ?方法 2.1動物分組及給藥清潔級昆明雄性小鼠48只，
4、體質(zhì)量18～20g。參照 2.6兩種方法測定 小鼠肝組織MDA含量的比較方法1：步驟同試劑盒說明書所述一致，各組小鼠肝勻漿樣品顯色后測定450nm、532nm波長下的吸光度值OD450、OD532，根據(jù)直線回歸方程求出各樣品中糖分在532nm處的吸光度值Y532。D532與Y532之差即是MDA-TBA反應(yīng)產(chǎn)物在532nm下的吸光度值，用該值進(jìn)一步計算得到樣品中MDA含量?！ 》椒?：以試劑盒上提供的傳統(tǒng)方法測定MDA含量?！ ?結(jié)果與分析 3.1小鼠肝組織中糖類物質(zhì)的含量 經(jīng)過多糖灌胃的小鼠，其肝組織中糖類物質(zhì)的含量均比對照組小鼠高。CG組、H
5、G組、MG組、LG組小鼠肝組織中糖類物質(zhì)的含量分別為(36.45±6.70),(47.05±9.57),(40.15±2.34),(38.64±9.41)mg/g。小鼠肝組織糖含量在對照組與試驗(yàn)組之間存在著較大差異?！ ?.2葡萄糖對TBA反應(yīng)的影響測定 3.2.1葡萄糖與TBA反應(yīng)的比色測定 葡萄糖與TBA反應(yīng)產(chǎn)物的吸收光譜如圖一所示，反應(yīng)產(chǎn)物在400～600nm處均有吸收值，其中在450nm處有峰值吸收。而趙世杰等［6］的研究表明，MDA與TBA顯色反應(yīng)產(chǎn)物在450nm處無吸收。因此可以在450nm測定吸光度值計算葡萄糖的含量，從而消除葡萄糖對M
6、DA-TBA顯色反應(yīng)的干擾?！ ?.2.2MDA-TBA反應(yīng)中糖類物質(zhì)干擾的排除(直線回歸法) 圖2顯示了葡萄糖與TBA反應(yīng)產(chǎn)物在在450nm，532nm處吸光度值間的相關(guān)關(guān)系。不同濃度的葡萄糖與TBA反應(yīng)產(chǎn)物在450nm處的吸光度值與532nm處的吸光度值成正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)達(dá)到0.9998。其直線回歸方程為：Y532=0.3284+0.0017OD450。樣品顯色后測定450nm、532nm波長下的吸光度值，根據(jù)方程求出該樣品中糖分在532nm處的吸光度值Y532，測定MDA含量時，通過校正，即減去Y532，可進(jìn)一步計算樣品中MDA的準(zhǔn)確含量。 3
7、.2.3MDA測定條件對樣品中肝糖原降解情況的影響 反應(yīng)體系中的葡萄糖來自于肝組織中的糖原在一定條件下的降解。因此，肝糖原的降解程度與葡萄糖對MDA含量測定的干擾程度緊密相關(guān)。圖3反映了MDA測定條件對樣品中肝糖原降解情況的影響，對照組樣品未經(jīng)過高溫和酸解，其還原糖的含量明顯低于處理過的樣品的還原糖含量。這說明高溫和酸性條件下，肝組織中的糖原會降解為具有還原性的葡萄糖。水浴時間的延長，并沒有改變樣品中還原糖含量，這說明糖原物質(zhì)的分解進(jìn)程較快。因此反應(yīng)時間對于MDA含量的測定沒有較大影響?！ ?.3兩種方法測定的小鼠肝組織MDA含量的比較 分別采用兩種
8、方法測定的小鼠肝組織MDA含量，結(jié)果如表1所示。糖類的存在對肝組織MDA含量的測
