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1、動物肝組織中丙二醛含量測定方法的改進論文【摘要】目的初步探討糖類物質(zhì)對肝組織中丙二醛（MDA）含量測定的干擾并改進測定方法。方法該實驗以含糖量不同的小鼠肝勻漿作為實驗材料，通過葡萄糖在450nm和532nm處吸光度值的正相關關系建立直線回歸方程，校正MDA在532nm處的吸光度值。計算出樣品中MDA含量。結果肝組織中糖類物質(zhì)會干擾MDA含量的測定，尤其是當樣品中糖量含量間差異較大時，糖的干擾可能導致對機體受損程度的錯誤評判。結論改進后的方法更為科學、準確，可應用于動物肝組織丙二醛含量的測定?！娟P鍵詞】丙二醛；靈芝多糖；葡萄糖；直線回
2、歸法丙二醛（Malomdialdehvde，MDA）是機體內(nèi)的氧自由基攻擊生物膜中的多不飽和脂肪酸，形成的脂質(zhì)過氧化物.freel處有最大吸收峰來進行測定的。這種方式常常受到多種物質(zhì)不同程度的干擾［2］。其中最主要的干擾因素是組織內(nèi)的可溶性糖。動物肝組織中含有大量的肝糖原，在測定時降解的葡萄糖會干擾測定。而探討動物組織中糖類物質(zhì)對MDA測定的干擾及消除方法還未見報道。本研究以含糖量不同的小鼠肝勻漿作為實驗材料，初步探討了葡萄糖對肝組織中MDA含量的測定的干擾并改進了測定方法。1材料1.1動物清潔級昆明種雄性小鼠，18～20g，由湖北
3、省疾病預防控制中心實驗動物研究中心提供。動物飼養(yǎng)室溫度為22～25℃，濕度為65%～80%。1.2試劑丙二醛（MDA）測定試劑盒，購于南京建成工程研究所。其它化學試劑均為分析醇。1.3儀器752型紫外光柵分光光度計（上海精密科學儀器有限公司）；飛鴿牌TGL-16C離心機（上海安亭科學儀器廠）；解剖剪。2方法2.1動物分組及給藥清潔級昆明雄性小鼠48只，體質(zhì)量18～20g。參照文獻［3］的方法，將實驗動物按體重隨機等數(shù)分為4組，即對照組（controlgroup，CG）、多糖高劑量組（high-dosegroup，HG）、多糖中劑量組
4、(medial-dosegroup，MG)、多糖低劑量組（lol/d生理鹽水灌胃，其余3組以0.3ml/d不同濃度的靈芝多糖溶液灌胃，多糖高、中、低劑量的服用量分別為200，100，50mg/(kg·d)。實驗期間小鼠自由攝食及飲水，每5天稱量1次體重，根據(jù)體重調(diào)整灌胃量，連續(xù)灌胃30d。2.2靈芝多糖的制備實驗室固體發(fā)酵所得靈芝菌絲體100g加入7L蒸餾水，85℃水提50min。過濾所得的上清用旋轉蒸發(fā)儀濃縮到0.1L后，加入0.1L無水乙醇4℃過夜沉淀，4000r/min離心20min后取沉淀用適量蒸餾水溶解，冷凍干燥得到的褐色
5、粉末為靈芝粗多糖。2.3肝勻漿的制備動物禁食過夜，次日頸椎脫臼處死、開胸、剖開腹腔。用4℃生理鹽水清洗肝臟，用濾紙吸干肝表面水分，稱肝重，加20倍干重的0.05mol/LPBS緩沖液在勻漿機內(nèi)勻漿，即制成5%肝勻漿。所有操作均在冰浴中進行。2.4小鼠肝組織糖類物質(zhì)含量的測定小鼠肝組織糖類物質(zhì)含量利用苯酚硫酸法［4］進行測定。2.5葡萄糖對TBA反應的影響測定2.5.1葡萄糖與TBA反應的比色測定因為肝組織存在較多的糖原，其在一定條件下可降解為葡萄糖，所以本實驗以葡萄糖為標準探討排除糖類物質(zhì)對MDA-TBA反應干擾的情況。參照MDA測
6、定試劑盒的測定方法，取200μl50mg/ml葡萄糖溶液，加入0.6%TBA（50%冰醋酸溶解配制）3.2ml，沸水浴80min后4000r/min離心10min，取上清液經(jīng)752型紫外光柵分光光度計400～700nm掃描并記錄結果。2.5.2MDA測定條件對樣品中肝糖原降解情況的影響取0.5ml5%肝勻漿上清液，加入1.5ml50%冰醋酸后沸水浴20～80min，并設置對照組：取0.5ml5%肝勻漿上清液，加入1.5ml蒸餾水。將各組反應液pH調(diào)至7.0后，加入2mlDNS溶液煮沸5min后［5］測定各樣品在540nm處吸收值的變
7、化。2.5.3MDA-TBA反應中糖類物質(zhì)干擾的排除(直線回歸法)取不同濃度（0～50mg/ml）的葡萄糖溶液，按照丙二醛（MDA）測定試劑盒上的說明，加入0.6%TBA（50%冰醋酸溶解配制）3.2ml，置沸水于中80min后4000r/min離心5min后，測定上清液在450nm和532nm下的吸光度值，分析其中的相關關系［5］。2.6兩種方法測定小鼠肝組織MDA含量的比較方法1：步驟同試劑盒說明書所述一致，各組小鼠肝勻漿樣品顯色后測定450nm、532nm波長下的吸光度值OD450、OD532，根據(jù)直線回歸方程求出各樣品中糖分
8、在532nm處的吸光度值Y532。D532與Y532之差即是MDA-TBA反應產(chǎn)物在532nm下的吸光度值，用該值進一步計算得到樣品中MDA含量。方法2：以試劑盒上提供的傳統(tǒng)方法測定MDA含量。3結果與分析3.1小鼠肝組織中糖類物質(zhì)的
