southern印跡雜交基本方法及主要步驟.doc

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1、基本概念及原理　　Southern印跡雜交是進行基因組DNA特定序列定位的通用方法。一般利用瓊脂糖凝膠電泳分離經(jīng)限制性內(nèi)切酶消化的DNA片段，將膠上的DNA變性并在原位將單鏈DNA片段轉(zhuǎn)移至尼龍膜或其他固相支持物上，經(jīng)干烤或者紫外線照射固定，再與相對應(yīng)結(jié)構(gòu)的標(biāo)記探針進行雜交，用放射自顯影或酶反應(yīng)顯色，從而檢測特定DNA分子的含量[1][2]?；痉椒爸饕襟E　　Southern印跡雜交的基本方法包括四部分，以下以植物southern印跡雜交為例。　?。?）植物基因組DNA提取；　　（2）DNA的限制性內(nèi)切酶酶解、電泳和Southern轉(zhuǎn)移；　?。?

2、）探針的標(biāo)記和純化；　?。?）雜交、洗膜、檢測以及去除膜上探針?！　≈饕僮鞑襟E：　　1．瓊脂糖電泳　?。?）取一定量的待測DNA樣品，用適當(dāng)?shù)南拗菩詢?nèi)切酶酶切。DNA的量根據(jù)樣品的種類及實驗?zāi)康牡牟煌?，對于克隆片段的限制性?nèi)切酶圖譜分析，取0.1-0.5μg即可；而對于鑒定基因組DNA中的單拷貝基因序列，則需要10～20μg；當(dāng)采用寡核苷酸探針或探針的比放射性活性較低時，則需要30～50μg。　?。?）酶切完畢，在瓊脂糖凝膠中電泳?！　。?）電泳結(jié)束后，EB染色，長波紫外線下觀察電泳結(jié)果及照相?！　?．印跡轉(zhuǎn)移　?。?）切膠并作標(biāo)記（左下角切除

3、），以便于定位，然后將凝膠置于一容器中。　　Southern印跡雜交轉(zhuǎn)膜示意圖（2）將凝膠浸泡于適量的變性液中，室溫下放置1h使之變性，不間斷地輕輕搖動。變性緩沖液：1.5mol/LNacl0.5mol/LNaOH　?。?）將凝膠用去離子水漂洗1次，然后浸泡于適量的中和液中30min，不間斷地輕輕搖動。更換中和液，繼續(xù)浸泡15min。　?。?）將濾紙，硝酸纖維素膜NC膜(以下簡稱NC膜）剪成與膠同樣大小，NC膜浸入轉(zhuǎn)移buffer中平衡30min。　?。?）按右圖操作：逐層鋪平，各層之間勿留有氣泡和皺折。（6）虹吸轉(zhuǎn)移12-16h。轉(zhuǎn)膜液：1.0mo

4、l/LNacl0.4mol/LNaOH3．固定DNA堿性轉(zhuǎn)移不需要固定，在中性緩沖液中室溫15分鐘。(1.0mol/LNacl0.5mol/LTris-Cl1　　)（1）取出轉(zhuǎn)移后的NC膜，用濾紙吸干NC膜，NC膜光面朝上平鋪于變性液中變性5min?！　。?）用相同的方法將NC膜平鋪在中性液上，中和兩遍，每遍5min?！　。?）將膜夾在兩張干燥濾紙間，80℃烘烤1-2h?！　?．預(yù)雜交　?。?）將膜浸入5×SSC中2min，將膜放入干凈的塑料袋中?！　。?）將預(yù)雜交液事先在65℃預(yù)熱，然后將10ml預(yù)雜交液加入袋中，封口?！　。?）65℃預(yù)雜交1h以

5、上，不時搖動。　　5．雜交　　（1）取出雜交袋，剪去一角去除雜交液后，加入5ml雜交液及5μl變性探針，排除氣泡后封口?！　。?）將雜交袋放入65℃水中雜交過夜。　　6．按下列條件洗膜（1）剪開雜交袋，用鑷子取出膜，放入裝有20mL的2×SSC0.1%SDS溶液的平皿中，在室溫下振蕩洗滌兩次，每次5分鐘。（2.）用鑷子將膜轉(zhuǎn)入0.1×SSC，0.1%SDS溶液(先放50℃水浴預(yù)熱)中，50℃水浴振蕩洗滌兩次，每次15分鐘。（3）用鑷子將膜取出轉(zhuǎn)入裝有20mL洗滌緩沖液的平皿中振蕩洗滌5分鐘。7．信號檢測（１）所需試劑：請按下表組分準(zhǔn)備所需試劑。溶液組

6、分/制備洗滌緩沖液0.1M順丁烯二酸,0.15MNaCl;pH7.5(20°C);0.3%(v/v)Tween-20順丁烯二酸緩沖液0.1M順丁烯二酸,0.15MNaCl;用NaOH調(diào)節(jié)到pH7.5(20°C)檢測緩沖液0.1MTris-HCl,0.1MNaCl,pH9.5(20°C)TE-緩沖液10mMTris-HCl,1mMEDTA,pH8.0（２）制備試劑盒工作液溶液組分/制備阻斷液用順丁烯二酸緩沖液1:10稀釋10×阻斷液，制備成1×工作液?？贵w溶液每次使用前，需10,000rpm離心抗Dig-AP酶結(jié)合物5分鐘，從表面小心吸取所需的量。用阻

7、斷液按1:5000稀釋抗體。顯色底物液加200ulNBT/BCIP到10ml檢測緩沖液中。（３）流程：在培養(yǎng)皿上進行信號檢測。注意:所有孵育過程應(yīng)在15-25°C下攪動進行，如果膜要用于再雜交，則不要讓膜在任何時候變干。步驟操作1在雜交和嚴謹洗滌后，在洗滌緩沖液中浸潤1-5分鐘。2在30ml阻斷液中孵育30分鐘。3在10ml抗體液中孵育30分鐘。4用30ml洗滌液洗滌2x15分鐘。5在15ml檢測緩沖液中平衡2-5分鐘。6在避光條件下，于10ml新鮮制備的顯色底物液中反應(yīng)顯色。在顯色過程中勿搖動。注意:在幾分鐘內(nèi)即有顏色開始沉淀，并在16h后完成反應(yīng)

8、。為檢測顯色程度，膜可以短時間暴露于光線下。7當(dāng)達到所需的點或帶強度后，用50ml雙蒸水或TE-緩沖液將膜漂