ARMS技術(shù)介紹教案資料.ppt

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1、ARMS技術(shù)的介紹（theamplificationrefractorymutationsystem）一、ARMS技術(shù)的原理二、ARMS技術(shù)的特點(diǎn)三、MGB探針及原理四、MGB探針的特點(diǎn)五、ARMS技術(shù)的應(yīng)用六、ARMS實(shí)例：β-地中海貧血位點(diǎn)主要內(nèi)容ARMS技術(shù)針對(duì)引物3’端進(jìn)行等位基因特異性的區(qū)分。兩種引物形式：“normal”野生型引物，擴(kuò)增時(shí)會(huì)被突變的模板阻滯；“mutant”突變型引物，擴(kuò)增時(shí)會(huì)被野生型模板阻滯。一般情況下，通過(guò)引物3’端單個(gè)堿基的突變來(lái)區(qū)分等位基因效果并不理想。所以ARMS技術(shù)在大多數(shù)情況下還會(huì)人為的增加引物3’端附近

2、的堿基的突變以達(dá)到區(qū)分等位基因的效果。N-6N-4N-2NN-3以kappacasein基因的一個(gè)突變位點(diǎn)為例二、ARMS技術(shù)的特點(diǎn)2.1ARMS技術(shù)具有高特異性。由于ARMS所用的引物是從一段序列在3’末端及其附近人為的加入錯(cuò)配的突變位點(diǎn)的一套引物組合中，通過(guò)篩選出來(lái)的能夠區(qū)分單個(gè)位點(diǎn)等位基因的引物，就保證了其高度的特異性:2.2ARMS技術(shù)具有高靈敏性檢測(cè)限可以達(dá)到100copies/mL，對(duì)于腫瘤組織檢測(cè)限可以達(dá)到0.5%的突變率。以BRAFV600E為例ARMS直接測(cè)序2.3檢測(cè)時(shí)耗短，成本低，結(jié)果直觀好判讀ARMS結(jié)合QPCR或者電泳技

3、術(shù)，均只需進(jìn)行一次PCR反應(yīng)，時(shí)耗短。ARMS技術(shù)需要優(yōu)化的僅僅是上游引物，這相對(duì)于使用MGB探針的熒光定量PCR技術(shù)來(lái)說(shuō)，成本低而且結(jié)果直觀好判讀。三、TaqmanMGB探針及其原理TaqmanMGB（Taqmanminorgroovebinder）探針由普通taqman探針和MGB基團(tuán)兩部分組成。Taqman-MGBRT-PCR原理4.1MGB探針的高Tm值由于MBG基團(tuán)對(duì)DNA雙鏈小溝具有高的親和性，因此在PCR反應(yīng)中，MGB探針相較于普通探針Tm值要高很多，通常要高出10-20℃。四、MGB探針的特點(diǎn)4.2MGB探針的特異性和靈敏性MGB

4、探針具有高的Tm值，可以很好的克服GC含量較低的模板的在探針設(shè)計(jì)時(shí)的困難，等位點(diǎn)突變序列間的Tm值相差很大，提高了檢測(cè)的特異性。同時(shí)，MGB探針包括一個(gè)不發(fā)熒光的猝滅基團(tuán)（NFQ），它能真正消除傳統(tǒng)猝滅基團(tuán)產(chǎn)生的背景熒光，提高信噪比，從而提供檢測(cè)靈敏性。檢測(cè)下限可達(dá)到50copies。4.3MGB探針結(jié)果判讀定量實(shí)驗(yàn)：一對(duì)引物，一條MGB探針。一般用于目標(biāo)位點(diǎn)的定量分析。定性實(shí)驗(yàn)：一對(duì)引物，一對(duì)探針。一般用于等位基因突變位點(diǎn)的分型。主要使用等位點(diǎn)分型點(diǎn)陣來(lái)分析。ARMS和MGB探針的比較比較項(xiàng)目ARMSMGB需要的引物探針一對(duì)引物，一條普通taq

5、man探針一對(duì)引物，一對(duì)taqmanMGB探針SNP位置SNP位點(diǎn)位于上游引物3‘位點(diǎn)SNP位點(diǎn)在探針序列中前期優(yōu)化成本及時(shí)長(zhǎng)優(yōu)化上游引物，序列固定，成本較低，優(yōu)化時(shí)間較短優(yōu)化探針序列，序列不固定，成本較高，優(yōu)化時(shí)間較長(zhǎng)結(jié)果判讀根據(jù)CT差值或CT值有無(wú)來(lái)判讀通過(guò)等位點(diǎn)分型點(diǎn)陣，根據(jù)點(diǎn)陣分布判讀特異性來(lái)源多條上游引物篩選出最優(yōu)引物探針組合；CT差值>15保證等位位點(diǎn)間的差異通過(guò)等位位點(diǎn)序列退火溫度Tm值差異保證盡量消除了非特異擴(kuò)增靈敏性來(lái)源前期優(yōu)化時(shí)，通過(guò)控制模板量（100-1000copies）保證檢測(cè)的下限采用NFQ作為淬滅基團(tuán)，消除背景信號(hào)，

6、增強(qiáng)靈敏度成品試劑盒成本只需一條探針，且探針價(jià)格較低，成品試劑盒的成本低需要兩條探針，且探針價(jià)格較貴，成品試劑盒的成本高五、ARMS技術(shù)的應(yīng)用5.1ARMS技術(shù)結(jié)合電泳和QPCR技術(shù)。目前采用電泳分析仍是主流，結(jié)合QPCR的還較少。毛細(xì)管電泳瓊脂糖凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳目前國(guó)內(nèi)用ARMS技術(shù)拿證的試劑盒有三個(gè)：1、產(chǎn)品名稱(chēng)：人KRAS基因突變檢測(cè)試劑盒(Taqman-ARMS法)注冊(cè)號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400363號(hào)生產(chǎn)單位：蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司2、產(chǎn)品名稱(chēng)：人EGFR基因突變檢測(cè)試劑盒(Taqman-ARMS法

7、)注冊(cè)號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2013第3400362號(hào)生產(chǎn)單位：蘇州工業(yè)園區(qū)為真生物醫(yī)藥科技有限公司3、產(chǎn)品名稱(chēng)：四項(xiàng)耳聾基因檢測(cè)試劑盒(ARMS-PCR法)注冊(cè)號(hào)：國(guó)食藥監(jiān)械(準(zhǔn))字2012第3400599號(hào)生產(chǎn)單位：中生北控生物科技股份有限公司謝謝！