產(chǎn)蛋白酶K畢赤酵母重組菌株高密度發(fā)酵.pdf

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1、產(chǎn)蛋白酶K畢赤酵母重組菌株高密度發(fā)酵及酶學(xué)性質(zhì)分析姓名：李善軍學(xué)號(hào)：2015304120225院系：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)生科院摘要蛋白酶K具有極高的酶活性和廣泛的底物特異性,在核酸純化、絲綢、醫(yī)藥、食品和釀造等領(lǐng)域蛋白酶K都有著重要的應(yīng)用。畢赤酵母是近十幾年來(lái)發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)體系，將蛋白酶K在畢赤酵母中重組表達(dá)將是突破其高效表達(dá)的一個(gè)重要步驟。本實(shí)驗(yàn)利用產(chǎn)蛋白酶K的畢赤酵母基因工程菌進(jìn)行高密度的液體發(fā)酵，掌握畢赤酵母菌全自動(dòng)液體發(fā)酵工藝，同時(shí)對(duì)的到產(chǎn)物酶酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析。經(jīng)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得知，畢赤酵母基因工程菌發(fā)酵最高密度達(dá)到濕重283.97g/L，得到的蛋白酶K最大酶活為29000U，蛋白酶K的

2、分子質(zhì)量為31ku,最適溫度為65度，最適PH為8，Na+、K+、Ca+和Mg+對(duì)蛋白酶K酶活有促進(jìn)作用，而Ni+和Zn+對(duì)酶活反應(yīng)則是抑制作用。關(guān)鍵詞：蛋白酶K、畢赤酵母菌、高密度發(fā)酵、酶學(xué)分析本實(shí)驗(yàn)的蛋白酶K屬絲氨酸蛋白酶類，它是林伯氏白色念球產(chǎn)生的一類主要蛋白酶。因能合成該種蛋白酶的微生物能在以角蛋白為唯一碳氮源的環(huán)境中生長(zhǎng)，故將其稱作蛋白酶K。蛋白酶K具有極高的酶活性和廣泛的底物特異性，能優(yōu)先分與疏水性氨基酸、含硫氨基酸、芳香族氨基酸C末端鄰接的酯鍵和肽鍵，常被用于降解蛋白生產(chǎn)短肽。利用其這個(gè)特性，在核酸純化、絲綢、醫(yī)藥、食品和釀造等領(lǐng)域蛋白酶K都有著重要的應(yīng)用。由于林伯氏白色

3、念球菌生長(zhǎng)緩慢難以達(dá)到高密度培養(yǎng)的目標(biāo)，而且菌體在產(chǎn)生蛋白酶K的同時(shí)還會(huì)分泌表達(dá)其他蛋白酶，加之對(duì)林伯氏白色念球菌的基因操作比大腸桿菌、酵母菌和枯草芽孢桿菌等常用基因工程菌困難許多，這些都給蛋白酶K的高效大規(guī)模生產(chǎn)帶來(lái)困難。畢赤酵母是近十年來(lái)發(fā)展起來(lái)的真核表達(dá)體系,它的生長(zhǎng)環(huán)境除了包括十分環(huán)保而廉價(jià)的無(wú)機(jī)鹽，微量元素和必須的碳氮源外，還要添加生物素，甲醇能夠作為它的唯一碳源保證其生長(zhǎng)。將蛋白酶K在畢赤酵母中重組表達(dá)將是突破其高效表達(dá)的一個(gè)重要步驟。本實(shí)驗(yàn)對(duì)產(chǎn)蛋白酶K的畢赤酵母基因工程菌高密度液體發(fā)酵工藝進(jìn)行探討，并對(duì)產(chǎn)物酶蛋白酶K的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行分析，使對(duì)產(chǎn)蛋白酶K的畢赤酵母基因工程菌及

4、其產(chǎn)物有一個(gè)較為深刻的理解。1、產(chǎn)蛋白酶K的畢赤酵母基因工程菌高密度液體發(fā)酵1.1種子液培養(yǎng)1.1.1種子培養(yǎng)基YPD培養(yǎng)基：酵母粉1%、蛋白胨2%、葡萄糖2%（瓊脂1.5%）YPG培養(yǎng)基：酵母粉1%、蛋白胨2%、甘油2%1.1.2培養(yǎng)溫度與菌齡挑取YPD平板上的單菌落（生科院發(fā)酵實(shí)驗(yàn)室）到8瓶100/500mLYPG培養(yǎng)基中，30℃，250r/min搖床培養(yǎng)28h。1.2發(fā)酵罐培養(yǎng)1.2.1菌體培養(yǎng)清洗干凈發(fā)酵罐，校正pH、DO電極后插入發(fā)酵罐，加入20LBSM（配方見下表）無(wú)機(jī)鹽培養(yǎng)基，115℃20min滅菌，完成后冷卻至30℃。通過補(bǔ)料泵調(diào)節(jié)pH值為5.0，按4%的接種量接種種子

5、液，并加入頭孢1g，PTM1為微量鹽87ml（4.35ml/L發(fā)酵液），通氣攪拌發(fā)酵。甘油分批階段完成時(shí),碳源耗盡，DO急劇上升，時(shí)間為24h。此時(shí)開始補(bǔ)加50%甘油進(jìn)入甘油補(bǔ)料階段，時(shí)間為6h。BSM:CaSO4K2SO4MgSO4.7H2OKOH磷酸甘油20L18.6g364g298g82.6g500ml500ml1.2.2甲醇誘導(dǎo)開始進(jìn)行碳源饑餓0.5h，開始補(bǔ)加甲醇進(jìn)入甲醇誘導(dǎo)產(chǎn)酶階段。同時(shí)注意溫度保持在30度，罐內(nèi)壓0.05MP,轉(zhuǎn)速500r/min,控制甲醇的流速，每6個(gè)小時(shí)取樣，測(cè)量菌體生物量。2、酶學(xué)性質(zhì)鑒定2.1酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作準(zhǔn)確稱取干燥的酪氨酸，配置0、20、

6、30、40、40、50、60、70、80ug/ml的酪氨酸溶液。用試管分別吸取不同濃度的酪氨酸1ml，各加入0.4ml的碳酸鈉5ml，再加入已稀釋的福林試劑1ml，搖勻放入水浴鍋中。40度保溫發(fā)色20min，在分光光度計(jì)進(jìn)行測(cè)定（660nm），測(cè)3次，取平均值。將各濃度的酪氨酸測(cè)得OD值減去0ug/ml的酪氨酸OD值得到凈OD值，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線如下圖1：酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線70y=101.34x-0.529660R2=0.99945040g/mLμ30濃度2010000.10.20.30.40.50.60.7吸光度（A660）圖12.2確定反應(yīng)最適ph配制50mmol/LpH6.0、pH7.0

7、、pH8.0、pH9.0、pH10.0、pH11.0、pH12.0、pH13.0的緩沖液。取1mL不同pH稀釋合適倍數(shù)的粗酶液，加入1mL用相同pH緩沖液配制的底物，混勻，65℃反應(yīng)10min。以O(shè)D660最高的酶活為100%，計(jì)算不同pH條件下的相對(duì)酶活。2.3確定反應(yīng)最適溫度1)配制合適的ph緩沖液，將粗酶液稀釋合適的倍數(shù)（根據(jù)前面的實(shí)驗(yàn)得到最適ph）。2)取稀釋好的酶液1mL，加入1mL2%的酪蛋白底物，分別在20℃，30℃，40℃，50