重組胰蛋白酶原在畢赤酵母中的高效表達(dá)

《重組胰蛋白酶原在畢赤酵母中的高效表達(dá)》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在學(xué)術(shù)論文-天天文庫。

1、工程碩士學(xué)位論文重組胰蛋白酶原在畢赤酵母中的高效表達(dá)作者姓名張宏達(dá)學(xué)科專業(yè)生物工程指導(dǎo)教師王菊芳教授陳超博士所在學(xué)院生物科學(xué)與工程學(xué)院論文提交日期2017年12月ThehighexpressionofrecombinanttrypsinogeninPichiapastorisADissertationSubmittedfortheDegreeofMasterCandidate：ZhangHongdaSupervisor：Prof.WangJufangSouthChinaUniversityofTechnologyGuangzhou，China分類號：Q819學(xué)校代號：10561學(xué)號：20

2、1220209307華南理工大學(xué)碩士學(xué)位論文重組胰蛋白酶原在畢赤酵母中的高效表達(dá)作者姓名：張宏達(dá)指導(dǎo)教師姓名、職稱：王菊芳教授申請學(xué)位級別：在職碩士學(xué)科專業(yè)名稱：生物工程論文形式?產(chǎn)品研發(fā)?工程設(shè)計?應(yīng)用研究?工程/項目管理?調(diào)研報告研究方向：重組蛋白表達(dá)論文提交日期：2017年12月04日論文答辯日期：2017年12月7日學(xué)位授予單位：華南理工大學(xué)學(xué)位授予日期：年月日答辯委員會成員：主席：鄭穗平委員：朱明軍、杜紅麗、梁書利、謝秋玲華南理工大學(xué)學(xué)位論文原創(chuàng)性聲明本人鄭重聲明：所呈交的論文是本人在導(dǎo)師的指導(dǎo)下獨立進行研究所。取得的研究成果除了文中特別加以標(biāo)注引用的內(nèi)容外，本論文

3、不包含任何其他個人或集體己經(jīng)發(fā)表或撰寫的成果作品。對本文的研究做出重要貢。獻的個人和集體，均己在文中以明確方式標(biāo)明本人完全意識到本聲明的法律后果由本人承擔(dān)。１Ｍ年丄：作者簽名：欠釔Ｉ日期月＾日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解學(xué)校有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，即：研究生在校攻讀學(xué)位期間論文工作的知識產(chǎn)權(quán)單位屬華南理工大學(xué)。學(xué)校有權(quán)保存并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和電子版，允許學(xué)位論文被查閱（除在保密期內(nèi)的保密論文外）；學(xué)?？梢怨紝W(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容，可以允許采用影印、縮印或其它復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位一論文。本人電子文

4、檔的內(nèi)容和紙質(zhì)論文的內(nèi)容相致。本學(xué)位論文屬于：□保密，在５年解密后適用本授權(quán)書＾０不保密意在校園網(wǎng)上發(fā)布，供校內(nèi)師生和與學(xué)校有共享協(xié)議的單，同位瀏覽；同意將本人學(xué)位論文提交中國學(xué)術(shù)期刊（光盤版）電子雜志社全文出。版和編入ＣＮＫＩ《中國知識資源總庫》，傳播學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容“”（請在以上相應(yīng)方內(nèi)打Ｖ＿）作者簽名：欠免忠日期年明３日指導(dǎo)教師簽名：日期：如詐（明ｓ日摘要胰蛋白酶是一種絲氨酸蛋白水解酶。在脊椎動物中，作為消化酶而起作用，它是肽鏈內(nèi)切酶，能把多肽鏈中賴氨酸和精氨酸殘基中的羧基側(cè)切斷。胰蛋白酶是特異性最強的蛋白酶之一，是決定蛋白質(zhì)的氨基酸排

5、列的不可或缺的工具。目前，胰蛋白酶主要有兩種來源，第一種是從動物（豬、牛等）的胰臟中提取得來的，工藝復(fù)雜且價格昂貴，較大程度上限制了胰蛋白酶的應(yīng)用。第二種是使用基因工程重組技術(shù)獲得產(chǎn)重組胰蛋白酶的微生物表達(dá)系統(tǒng)，經(jīng)過發(fā)酵表達(dá)再進行純化提取。本文采用第二種方法，利用基因工程畢赤酵母菌（P.pastoris）進行高密度發(fā)酵工藝高效表達(dá)重組胰蛋白酶原。結(jié)果表明，胰蛋白酶原的生產(chǎn)水平較高，且激活的胰蛋白酶的酶切特異性與動物胰腺來源的胰蛋白酶相同。相比動物胰腺提取的胰蛋白酶，重組胰蛋白酶具有無外源性病毒污染，不存在其它雜酶的污染，酶切反應(yīng)的特異性較高，不存在其它副反應(yīng)等優(yōu)勢。本文旨在探討重組胰蛋白

6、酶原在P.pastoris中的表達(dá)，并實質(zhì)性地進行了工業(yè)化生產(chǎn)及應(yīng)用。本文通過分子克隆獲得胰蛋白酶原基因（參照歐洲專利EP1399568B1）構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒，重組表達(dá)質(zhì)粒經(jīng)過電轉(zhuǎn)化進入宿主GS115中進行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)表達(dá)篩選后獲得胰蛋白酶原高產(chǎn)重組工程菌，菌株命名為P.pastorisGS115/pPIC9K-BdP4WB54。其次，本文對該工程菌的形態(tài)、生化特征和遺傳特征進行了研究，并建立了該菌株的主細(xì)胞庫(MasterCellBank，MCB)和工作細(xì)胞庫(WorkingCellBank，WCB)。通過對該細(xì)胞庫的傳代穩(wěn)定性進行了全面的考察，以確定該細(xì)胞庫能夠穩(wěn)定傳代并持續(xù)表達(dá)目標(biāo)

7、蛋白。試驗結(jié)果表明，該重組胰蛋白酶原工程菌具有典型的P.pastoris形態(tài)和生化特征，且目的基因準(zhǔn)確整合到宿主細(xì)胞基因組上；經(jīng)過傳代30次后，該工程菌傳代穩(wěn)定，這說明重組基因穩(wěn)定并能持續(xù)穩(wěn)定地表達(dá)目標(biāo)蛋白。再次，本試驗對獲得的工程菌株的發(fā)酵工藝在50L試驗規(guī)模上進行了優(yōu)化，包括：接種時間、接種量、培養(yǎng)基、誘導(dǎo)菌體濃度、誘導(dǎo)pH、誘導(dǎo)溫度、甲醇補加速率、有機氮源補加量、尿素補加速率和發(fā)酵周期等。結(jié)果在優(yōu)化后的工藝條件下，取得7.5g