雙抗體夾心法.doc

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1、......1.雙抗體夾心法雙抗體夾心法，屬于非競爭結(jié)合測定。它是檢測抗原最常用的ELISA，適用于檢測分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測。其基本工作原理是：利用連接于固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢測抗原分子上兩個抗原決定簇結(jié)合，形成固相抗體-抗原-酶標(biāo)抗體免疫復(fù)合物。由于反應(yīng)系統(tǒng)中固相抗體和酶標(biāo)抗體的量相對于待測抗原是過量的,因此復(fù)合物的形成量與待測抗原的含量成正比(在方法可檢測圍)。測定復(fù)合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物質(zhì)量(OD值)，即可確定待測抗原含量。若固相載體上的抗體和酶標(biāo)抗體分別與樣品中被檢

2、測抗原分子上兩個不同的抗原決定簇結(jié)合，則屬于雙位點(diǎn)夾心法。若采用固相載體上的抗原和酶標(biāo)抗原分別與樣品中被檢測抗體分子結(jié)合，則是雙抗原夾心法。操作步驟：⑴將特異性抗體包被固相載體McAb。孵育一定時間，使形成固相抗體，洗滌除去未結(jié)合的抗體和雜質(zhì)。⑵加待檢標(biāo)本，孵育，使標(biāo)本中的抗原與固相載體上的抗體充分反應(yīng)，形成固相抗原抗體復(fù)合物。洗滌除去其他未結(jié)合物質(zhì)。⑶加酶標(biāo)抗體，孵育，使形成固相抗體-待測抗原-酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物。洗滌除去未結(jié)合酶標(biāo)抗體。⑷加底物顯色。固相上的酶催化底物產(chǎn)生有色產(chǎn)物,通過比色,測標(biāo)本中抗原的量?，F(xiàn)多采用針對單一抗原決定簇特異性的單克隆抗體做

3、固相化和酶標(biāo)抗體，則受檢樣品和酶標(biāo)抗體可一次性加入，簡化流程，縮短反應(yīng)時間。若標(biāo)本中待測抗原濃度過高，抗原可分別與酶標(biāo)抗體和固相抗體結(jié)合而不形成上述夾心復(fù)合物(類似于免疫沉淀反應(yīng)中抗原過剩時的后帶現(xiàn)象)，使最終結(jié)果低于實(shí)際含量(鉤狀效應(yīng))，甚至出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。因此對此類標(biāo)本應(yīng)適當(dāng)稀釋后再測定。另外，當(dāng)血清中存在類風(fēng)濕因子（RF）時，類風(fēng)濕因子（RF）可充當(dāng)抗原，而形成固相抗體-類風(fēng)濕因子-酶標(biāo)抗體夾心復(fù)合物，從而出現(xiàn)假陽性結(jié)果。2.間接法此法是測定抗體最常用的方法,屬非競爭結(jié)合試驗。其原理是將抗原連接到固相載體上，樣品中待測抗體與之結(jié)合成固相抗原-受檢抗體復(fù)

4、合物，再用酶標(biāo)二抗(針對受檢抗體的抗體，如羊抗人IgG抗體)與固相免疫復(fù)合物中的抗體結(jié)合，形成固相抗原-受檢抗體-酶標(biāo)二抗復(fù)合物，測定加底物后的顯色程度，確定待測抗體含量。操作步驟⑴將已知抗原包被固相載體,形成固相抗原。洗滌除去未結(jié)合的抗原及雜質(zhì)。⑵封閉:用高濃度無關(guān)蛋白封閉,阻止待檢血清中非特異IgG吸附固相。⑶加待檢血清，孵育，使固相抗原和待檢抗體充分結(jié)合，洗滌除去未結(jié)合的非特異抗體及其他血清成分。⑷加酶標(biāo)抗體或酶標(biāo)SPA，孵育，形成固相抗原-待檢抗體-酶標(biāo)抗抗體(或酶標(biāo)SPA)復(fù)合物。⑸加底物顯色。間接法由于采用的酶標(biāo)二抗是針對一類免疫球蛋白分子(如抗

5、人IgG),因此該法只需要換固相抗原，即可用一種酶標(biāo)二抗檢測各種與抗原相應(yīng)的抗體，具有更廣泛的通用性。.s.............3.競爭法競爭法ELISA可用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進(jìn)行檢測。其方法和特點(diǎn)是：①酶標(biāo)記抗原（抗體）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)體中的非標(biāo)記抗原或抗體具有相同的與固相抗體（抗原）結(jié)合的能力；②反應(yīng)體系中，固相抗體（抗原）和酶標(biāo)抗原（抗體）是固定限量，且前者的結(jié)合位點(diǎn)少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記抗原（抗體）的分子量和；③免疫反應(yīng)后，結(jié)合于固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標(biāo)抗原（抗體）的量（酶活性）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中非標(biāo)記抗原（抗體）的濃度成反比。操作

6、步驟⑴將已知抗體包被載體,形成固相抗體。洗滌除去未結(jié)合物。⑵加入待檢標(biāo)本和酶標(biāo)抗原，孵育，使兩者與固相抗體競爭結(jié)合。洗滌除去未結(jié)合到固相上的游離酶標(biāo)抗原及其他未結(jié)合物。⑶加底物顯色。顏色深淺與待測抗原量成反比。同理，也可用固相抗原和酶標(biāo)抗體作試劑，使固相抗原和標(biāo)本中的待檢抗原競爭結(jié)合酶標(biāo)抗體。待檢抗原競爭抑制酶標(biāo)抗體和固相抗原結(jié)合，即待檢抗原越多，顯色越淺。以抗原測定為例，先將特異性抗體連接于固相載體，分別設(shè)置對照管和樣品測定管；對照管中僅加酶標(biāo)抗原，加樣后，無非標(biāo)記抗原競爭，酶標(biāo)抗原即與固相抗體充分結(jié)合；而測定管抗原與后者的結(jié)合受到抑制而減少。加酶底物顯色

7、后，對照管因固相抗體上結(jié)合的酶標(biāo)抗原多，顯色深，測定管則依被檢抗原和酶標(biāo)抗原競爭結(jié)合固相抗體程度不同而顯色深淺有異：被檢抗原多，酶標(biāo)抗原與固相抗體結(jié)合少，底物顯色反應(yīng)弱，色淺；反之呈色深。即結(jié)合于固相的酶標(biāo)抗原量與樣品中被檢抗原濃度負(fù)相關(guān)。計算測定管與對照管顏色深度（OD值）之差，即可確定被檢抗原量。4.捕獲法捕獲法（亦稱反向間接法）ELISA，主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定。以目前最常用的IgM測定為例，因血清中針對某種抗原的特異性IgM和IgG同時存在，則后者可干擾IgM的測定。因此捕獲法的工作原理設(shè)計為：先將針對IgM的第二抗體（如羊

8、抗人IgMμ鏈抗體）連接于固相載體，用以結(jié)合（“捕獲