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1、標(biāo)記抗體技術(shù)免疫標(biāo)記技術(shù)是將一些既易測(cè)定又具有高度敏感性的物質(zhì)標(biāo)記到特異性抗原或抗體分子上，通過(guò)這些標(biāo)記物的增強(qiáng)放大效應(yīng)來(lái)顯示反應(yīng)系統(tǒng)中抗原或抗體的性質(zhì)與含量。常用的標(biāo)記物包括熒光素、酶和放射性核素等，用這3種標(biāo)記物進(jìn)行標(biāo)記的免疫檢測(cè)技術(shù)被稱為3大免疫標(biāo)記技術(shù)。目前，使用的免疫標(biāo)記物還有化學(xué)發(fā)光物質(zhì)、鐵蛋白和膠體金等。一、辣根過(guò)氧化物酶(HRP)標(biāo)記抗體a.辣根過(guò)氧化物酶(HorseradishPeroxidase,HRP）?HRP廣泛分布于植物界，它是由無(wú)色的酶蛋白和棕色的鐵卟啉結(jié)合而成的糖蛋白，糖含量18％。HRP由多個(gè)同功酶組成，分子量為40,0
2、00,等電點(diǎn)為pH3～9，酶催化的最適PH因供氫體不同而稍有差異，但多在pH5左右。酶溶于水和58％以下的硫酸銨溶液。HRP的輔基和酶蛋白最大吸收光譜分別為403nm和275nm，一般以O(shè)D403nm／OD275nm的比值RZ(德文ReinheitZahl)表示酶的純度。??HRP的催化反應(yīng)需要底物過(guò)氧化氫(H2O2)和供氫體(DH2)。供氫體多為無(wú)色的還原型染料，通過(guò)反應(yīng)可生成有色的氧化型染料(D)。HRPDH2＋H2O2──────→D＋2H2Ob.辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記方法酶標(biāo)記抗體的制備方法主要有兩種，即戊二醛交聯(lián)法和過(guò)碘酸鹽氧化法。辣根過(guò)氧化物酶
3、的標(biāo)記常用過(guò)碘酸鹽氧化法，這種方法法只適用于含糖量較高的酶。過(guò)碘酸鈉將HRP分子表面的多糖氧化為醛基，醛基與抗體分子上的氨基形成Schiff堿而結(jié)合。后者可進(jìn)一步用NaBH４(或乙醇胺)還原生成穩(wěn)定的酶標(biāo)記抗體。在酶標(biāo)過(guò)程中一般都混有未結(jié)合的酶和抗體。游離酶理論上不影響最終的顯色。但游離的抗體則不同，它會(huì)與酶標(biāo)抗體競(jìng)爭(zhēng)固相抗原，從而減少了結(jié)合到固相上的酶標(biāo)抗體的量。因此需要對(duì)制備的酶結(jié)合物進(jìn)行純化，去除游離的酶和抗體。純化的方法很多，硫酸銨鹽析法最為簡(jiǎn)便，但效果并不理想。用離子交換層析、分子篩法可得到最佳的分離效果，但費(fèi)用較貴。二、免疫熒光標(biāo)記技術(shù)免疫
4、熒光細(xì)胞化學(xué)是根據(jù)抗原抗體反應(yīng)的原理，先將已知的抗原或抗體標(biāo)記上熒光素制成熒光標(biāo)記物，再用這種熒光抗體（或抗原）作為分子探針檢查細(xì)胞或組織內(nèi)的相應(yīng)抗原（或抗體）。在細(xì)胞或組織中形成的抗原抗體復(fù)合物上含有熒光素，利用熒光顯微鏡觀察標(biāo)本，熒光素受激發(fā)光的照射而發(fā)出明亮的熒光（黃綠色或桔紅色），可以看見(jiàn)熒光所在的細(xì)胞或組織，從而確定抗原或抗體的性質(zhì)、定位，以及利用定量技術(shù)測(cè)定含量。用熒光抗體示蹤或檢查相應(yīng)抗原的方法稱熒光抗體法，較常用。用免疫熒光技術(shù)顯示和檢查細(xì)胞或組織內(nèi)抗原或半抗原物質(zhì)等方法稱為免疫熒光細(xì)胞（或組織）化學(xué)技術(shù)。免疫熒光細(xì)胞化學(xué)分直接法、夾心
5、法、間接法和補(bǔ)體法。?常用熒光素：FITC????吸收光譜490-495,發(fā)射光譜520-530nm,分子量389.4?黃綠色熒光TMRITC吸收光譜550,發(fā)射光譜620,橙紅色熒光TEXASRED吸收光譜590-595?,發(fā)射光譜620-630nm,分子量625.15SITSAMC?藍(lán)色熒光澡紅素R花青三、凝集素標(biāo)記技術(shù)凝集素是一類從各種植物種子和動(dòng)物組織中提取的糖蛋白或結(jié)合糖的蛋白。因其能凝集紅細(xì)胞，故名凝集素，亦稱外源凝集素。除紅細(xì)胞外，還能凝集淋巴細(xì)胞、纖維細(xì)胞、精子等。常用的為植物凝集素。通常以其提取的植物命名，如刀豆素A、麥胚凝集素、植物
6、血激素、花生凝集素等，凝集素(Ietin)是其總稱。日前已純化并鑒定的植物凝集素有近100種。凝集素最大的特點(diǎn)是能識(shí)別糖蛋白和糖脂中，特別是細(xì)胞膜中復(fù)雜的碳水化合物結(jié)構(gòu)，即細(xì)胞膜表面的糖基。一種凝集素具有只對(duì)某一種特異性糖基專一性結(jié)合的能力．如刀豆素A與吡喃糖基甘露糖結(jié)合。因此，凝集素可以作為研究細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)的探針。另一方面，凝集素具有多價(jià)結(jié)合能力，能與熒光素、酶、生物素、鐵蛋白及膠體金等結(jié)合、而不影響其生物活性，可用于光鏡或電鏡水平的免疫細(xì)胞化學(xué)研究工作，在探索細(xì)胞分化、增生和惡變的生物學(xué)演變過(guò)程，顯示腫瘤相關(guān)抗原物質(zhì)，以及對(duì)腫瘤的診斷評(píng)價(jià)等方面均有一
7、定的價(jià)值。四、免疫膠體金技術(shù)免疫膠體金技術(shù)是80年代繼三大標(biāo)記技術(shù)（熒光素、放射性同位素和酶）后發(fā)展起來(lái)的固相標(biāo)記免疫測(cè)定技術(shù)。最初該方法僅用于免疫電鏡技術(shù)，現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)展到被動(dòng)凝集試驗(yàn)、光鏡染色、免疫印跡、免疫斑點(diǎn)滲濾法以及免疫層析技術(shù)等。目前已廣泛應(yīng)用于臨床診斷，尤其是在醫(yī)學(xué)臨床檢驗(yàn)中的應(yīng)用，如早孕、乙肝、寄生蟲(chóng)、性病和病毒細(xì)菌病的檢測(cè)。而動(dòng)物醫(yī)學(xué)臨床診斷方面的應(yīng)用起步較晚，最近幾年才偶有報(bào)道，但作為臨床診斷試劑盒開(kāi)發(fā)應(yīng)用的還很少。該方法最大特點(diǎn)是單份測(cè)定、簡(jiǎn)單快速、特異敏感，像層析試紙條技術(shù)，不需任何儀器設(shè)備和試劑，幾分鐘就可用肉眼觀察到顏色鮮明的
8、實(shí)驗(yàn)結(jié)果，并可保存實(shí)驗(yàn)結(jié)果。免疫膠體金層析技術(shù)現(xiàn)已成為當(dāng)今最快速敏感的免疫學(xué)檢測(cè)技術(shù)之一，特別
