熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)

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1、熒光素標(biāo)記抗體技術(shù)(一)　原理目前用于抗體標(biāo)記的熒光素主要有異硫氰酸熒光素(Fluoresceinisothiocynate,FITC)或羅達(dá)明(LissaminerhodamineB200,RB200)。在鹼性條件下FITC的碳酰胺鍵可與抗體賴氨酸的ε氨基共價結(jié)合，標(biāo)記后的抗體仍保持與相應(yīng)抗原結(jié)合的能力。在熒光燈源紫外線或蘭紫光激發(fā)下產(chǎn)生黃綠色熒光，通過在熒光顯微鏡下觀察或流式細(xì)胞儀分析可對相應(yīng)抗原進(jìn)行定性、定位或定量的檢測。(二)　操作步驟　　　　將純化的IgG抗體對PH9～9.5碳酸鹽緩沖液透析過夜，　　　　透析

2、后抗體液移入小燒杯中　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　稱取適量IFTC，加入二甲亞砜(DMSO)(FITC～1mg/1mlDMSO)　　　　使終濃度為1mgFITC／1mlDMSO　　　　FITC／IgG比例:如IgG濃度為1mg／ml，F(xiàn)ITC／IgG比例約為50μgFITC／mgIgG；　　　　如IgG為5～10mg／ml，則比例為25μgFITC／mlIgG　　　　在10ml小燒杯中先放入抗體　　　　　　　　　　　　　　↓　　　　按上述比例將FITC-DMSO溶液逐滴加入透析后的抗體溶液中　　　　　　　　　　

3、　↓　　　　將標(biāo)記物用PBS加至2.5ml，磁力攪拌器室溫下避光攪拌2h　　　　　　　　　　　↓　　　　用PD10柱(SephadexG25柱)除去游離熒光素，先用25mlPBS淋洗G25柱　　　　　　　　　　　↓　　　　收集PBS洗脫第一個熒光素結(jié)合蛋白峰，測定F／P　　　　比值。第二個熒光素峰為游離熒光素　　　　計算:　　　　　　　　　2.87×A495　　　　F／P＝────────　　　　　　　　A280-0.35×A495　　　　合適的F／P值為2～4。(三)　試劑器材　　1.　純化的多克隆抗體或單克隆抗體。

4、　　2.　FITC(Fluorescein-5-Lsothiocyanalte)或其它熒光色素。　　3.　PBS、DMSO　　4.　PH9～9.5碳酸鹽緩沖液:Na2CO34.3g，NaHCO38.6g加蒸餾水至500ml?！　?.　PD10柱(SephadexG25柱)6.磁力攪拌器，紫外分光光度計等(四)　注意事項　　1.　FITC保存于4℃暗處，使用前待試劑瓶升至室溫時開蓋稱取，以避免潮解?！　?.　FITC-DMSO液要臨用時配制?！　?.　碳酸鹽緩沖液要新鮮配制。