熒光素標(biāo)記原理

《熒光素標(biāo)記原理》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、堿性磷酸酶標(biāo)記的鏈霉親和素－生物素法（SAP法）免疫組織化學(xué)實(shí)驗(yàn)二實(shí)驗(yàn)材料1、小鼠胰腺的石蠟切片；2、胰島素抗體（鼠抗人單克隆抗體）；3、SAP檢測(cè)試劑盒；4、正常羊血清；5、0.01MPBS（pH7.2～7.6）；6、BCIP/NBT顯色試劑；7、孵育濕盒。實(shí)驗(yàn)原理ABC法SAP法實(shí)驗(yàn)方法或步驟1、石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗，PBS浸泡2min；(如需采用抗原修復(fù)，可在此步后進(jìn)行)。2、10％正常羊血清封閉，室溫孵育10min；3、傾去血清，勿洗，滴加適當(dāng)比例稀釋的胰島素一抗或一抗工作液，37℃孵育45min。PBS沖洗，3×3min；4、滴加生物素標(biāo)

2、記羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育20min；5、PBS沖洗，3×3min；6、滴加堿性磷酸酶標(biāo)記鏈霉親和素工作液，37℃或室溫孵育20min。PBS沖洗，3×3min；7、顯色劑顯色（BCIP/NBT）；8、自來水充分沖洗，封片。結(jié)果胰島內(nèi)可見藍(lán)色或紫藍(lán)色著色的陽性細(xì)胞，陽性產(chǎn)物見于細(xì)胞質(zhì)多聚鰲合物酶法HRP---多聚化合物---抗體一、Epos法Enhancedpolymerone-stepstaining組織抗原一抗HRP多聚化合物骨架EPOS方法原理：采用一種具有惰性的多聚化合物作為骨架，將特異性抗體和HRP，同時(shí)標(biāo)記在多聚合物分子上，形成HRP-

3、--多聚化合物---特異性抗體。步驟：一步法特點(diǎn)：快速，簡(jiǎn)便，特異性強(qiáng)，敏感性高但商品化種類不全，價(jià)格昂貴二、EnVision法（或PowerVison）EnhancedLabelledPolymerSystem原理：HRP---多聚化合物---第二抗體組織抗原一抗二抗酶多聚化合物骨架第一步第二步PowerVision方法特點(diǎn)：敏感性高：（每個(gè)多聚鰲合物中含70個(gè)HRP分子和10個(gè)第二抗體）特異性強(qiáng)：復(fù)合物內(nèi)無內(nèi)源性Avidin和Biotin的干擾?；静僮鞑襟E1.抗原修復(fù)2.內(nèi)源性過氧化物抑制3.正常血清封閉4.第一抗體5.多聚骨架復(fù)合物6.顯色實(shí)驗(yàn)步

4、驟1、石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3×3min；2、3%H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水洗，PBS浸泡5min；3、滴加適當(dāng)比例稀釋的胰島素一抗工作液，37℃孵育1hr；4、PBS沖洗，3×3min；5、滴加HRP標(biāo)記羊抗小鼠Ig多聚體，37℃或室溫孵育20～30min；6、PBS沖洗，3×3min；7、顯色劑顯色（AEC或DAB）；8、自來水充分沖洗，封片。結(jié)果：胰島內(nèi)可見棕色著色的陽性細(xì)胞，陽性產(chǎn)物見于細(xì)胞質(zhì)。