熒光素標記原理

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1、堿性磷酸酶標記的鏈霉親和素－生物素法（SAP法）免疫組織化學實驗二實驗材料1、小鼠胰腺的石蠟切片；2、胰島素抗體（鼠抗人單克隆抗體）；3、SAP檢測試劑盒；4、正常羊血清；5、0.01MPBS（pH7.2～7.6）；6、BCIP/NBT顯色試劑；7、孵育濕盒。實驗原理ABC法SAP法實驗方法或步驟1、石蠟切片脫蠟至水，蒸餾水洗，PBS浸泡2min；(如需采用抗原修復，可在此步后進行)。2、10％正常羊血清封閉，室溫孵育10min；3、傾去血清，勿洗，滴加適當比例稀釋的胰島素一抗或一抗工作液，37℃孵育45min。PBS沖洗，3×3min；4、滴加生物素標

2、記羊抗鼠IgG工作液，37℃孵育20min；5、PBS沖洗，3×3min；6、滴加堿性磷酸酶標記鏈霉親和素工作液，37℃或室溫孵育20min。PBS沖洗，3×3min；7、顯色劑顯色（BCIP/NBT）；8、自來水充分沖洗，封片。結果胰島內(nèi)可見藍色或紫藍色著色的陽性細胞，陽性產(chǎn)物見于細胞質(zhì)多聚鰲合物酶法HRP---多聚化合物---抗體一、Epos法Enhancedpolymerone-stepstaining組織抗原一抗HRP多聚化合物骨架EPOS方法原理：采用一種具有惰性的多聚化合物作為骨架，將特異性抗體和HRP，同時標記在多聚合物分子上，形成HRP-

3、--多聚化合物---特異性抗體。步驟：一步法特點：快速，簡便，特異性強，敏感性高但商品化種類不全，價格昂貴二、EnVision法（或PowerVison）EnhancedLabelledPolymerSystem原理：HRP---多聚化合物---第二抗體組織抗原一抗二抗酶多聚化合物骨架第一步第二步PowerVision方法特點：敏感性高：（每個多聚鰲合物中含70個HRP分子和10個第二抗體）特異性強：復合物內(nèi)無內(nèi)源性Avidin和Biotin的干擾?；静僮鞑襟E1.抗原修復2.內(nèi)源性過氧化物抑制3.正常血清封閉4.第一抗體5.多聚骨架復合物6.顯色實驗步

4、驟1、石蠟切片脫蠟至水，PBS洗3×3min；2、3%H2O2室溫孵育10min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶的活性；蒸餾水洗，PBS浸泡5min；3、滴加適當比例稀釋的胰島素一抗工作液，37℃孵育1hr；4、PBS沖洗，3×3min；5、滴加HRP標記羊抗小鼠Ig多聚體，37℃或室溫孵育20～30min；6、PBS沖洗，3×3min；7、顯色劑顯色（AEC或DAB）；8、自來水充分沖洗，封片。結果：胰島內(nèi)可見棕色著色的陽性細胞，陽性產(chǎn)物見于細胞質(zhì)。