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《熒光素fitc標記抗體的方法》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、熒光素FITC標記抗體的方法當FITC在堿性溶液中與抗體蛋白反應(yīng)時，主要是蛋白質(zhì)上賴氨酸的r氨基與熒光素的硫碳胺鍵(thiocarbmide)結(jié)合，形成FITC-蛋白質(zhì)結(jié)合物，即熒光抗體或熒光結(jié)合物。一個IgG分子中有86個賴氨酸殘基，一般最多能結(jié)合15～20個，一個IgG分子可結(jié)合2～8個分子的FITC，其反應(yīng)式如下 FITC-N=C=S+N-H2-蛋白質(zhì)→FITC-NS-C-N-H2-蛋白質(zhì) 常用Marsshall(1958)法標記熒光抗體，也可以根據(jù)條件采用Chadwick等標記法或Clark等(1963)的透析標記法。 1．Ma
2、rsshall法 (1)材料抗體球蛋白溶液、0．5mol／L(pH9．0)碳酸鹽緩沖液、無菌生理鹽水、異硫氰酸熒光 素、1％硫柳汞水溶液、50ml小燒杯、4℃冰箱、電磁攪拌器、透析袋、玻棒、pH7．2或 3．0的0．01mol／LPBS等。 (2)方法及步驟①抗體的準備取適量已知濃度的球蛋白溶液于燒杯中，再加人生理鹽水及碳酸鹽緩沖液，使最后免疫球蛋白濃度為20mg／ml，碳酸鹽緩沖液容量為總量的1／10，混勻，將燒瓴置電磁攪拌器上(速度適當以不起泡沫為宜)5～10min?！ 、跓晒馑氐臏蕚涓鶕?jù)欲標記的蛋白質(zhì)總量，按每毫克免疫球蛋白加0
3、．01mg熒光色素，用分析天平準確稱取所需的異硫氰酸熒光素粉末。也可用下述公式計算出免疫球蛋白、熒光素的量，還可以算出需加緩沖液的量?！ ．蛋白溶液：含量Amg／m1；容積Bml。 b．總蛋白量(AXB)＝Crag?！ ．C／20～C／10＝Dmg(如蛋白含量低于20mg／ml，用C／10；如高于20mg／ml，用C／20)?！ ．熒光素FITC的量：(1／50～2／100)XC＝Emg?！ ．巳0．5mol／L(pH9．5)碳酸鹽緩沖液D／10＝Fml?！ ．PBS量D-(B+F)=Gml?！ ∽ⅲ篈為蛋白含量，mg／ml；B為
4、蛋白質(zhì)溶液的容積；C為蛋白總量，mg；D為常數(shù)，mg；正為熒光素的量，mg；F為碳酸鹽緩沖液的容積，ml；G為PBS的容積，ml?！ 、劢Y(jié)合(或標記)邊攪拌邊將稱取的熒光色素漸漸加入球蛋白溶液中，避免將熒光素粘于燒瓶壁(大約在5—10min內(nèi)加完)，加完后，繼續(xù)避光攪拌12h左右。結(jié)合期間應(yīng)保持蛋白溶液于4℃左右，故需將燒杯和攪拌器一起移人4℃冰箱中。 ?、芡肝鼋Y(jié)合完畢后，將標記的球蛋白溶液離心(2500r／min)20rain，除去其中少量的沉淀物，裝入透析袋中，再置于燒杯中，用pH8．0緩沖鹽水透析(0～4~C)過夜?！ 、葸^柱取透析過夜
5、的標記物，通過葡聚糖凝膠SephadexG-25或G—50柱，分離游離熒光素，收集標記的熒光抗體進行鑒定。洗脫液：0．01mol／L磷酸鹽緩沖液(pH7．2)；過濾量：12ml標記全球蛋白液(過濾前未透析)；收集量：20ml(稀釋1．7倍左右)?！ ?．Chadwick法 (1)試劑和材料抗體球蛋白溶液、異硫氰酸熒光素、3%碳酸鈉水溶液、0．01mol/LpH8.0PBS、1%硫柳汞、離心機及離心管、燒杯（25ml）攪拌器、無菌吸管，無菌吸管及毛細滴管、燒杯（500ml）透析袋等?！ ?2)方法及步驟①抗體準備用o～4~C的pH8。0磷酸鹽
6、緩沖鹽水將球蛋白溶液稀釋至濃度為30～40mg／ml，置入25ml燒杯內(nèi)，放于冰槽中?！ 、跓晒馍販蕚浒疵亢量嗣庖咔虻鞍准尤霟晒馑?．01rug計算，稱取所需的熒光素，用3％碳酸鈉水溶液溶解?！ 、蹖蕚涞目贵w與熒光色素溶液等量混合，充分攪勻，在o～4~C冰箱中結(jié)合(最好在磁力攪拌機上持續(xù)攪拌)18～24h?！ 、芡肝龊椭鶎游龇椒ㄍ琈arsshall法。 3．改良法 (1)試劑和材料①0．01mol／L(pH7．2)PBS配法中，校定pH至7．2。NaCi18g、Na2HP041．15g，溶于2000ml蒸餾水 ?、?．5mol／L(p
7、H9．0)碳酸鹽緩沖液配法取0．5mol／LNazCOs(5．3％)10ml加入0．5mol／LNaHC03(4．2％)90ml，混合后，校定pH至9．0?！ 、?％碳酸鈉水溶液配法稱L5g無水碳酸鈉充分溶解于50ml滅菌蒸餾水中即成。 ?、芷渌噭┖筒牧蟣％疊氮化鈉、離心機及離心管、燒杯(25m1)、攪拌器、無菌吸管及毛細滴管、燒杯(500m1)透析袋等?！ ?2)方法及步驟①取高效價的抗人球蛋白兔免疫血清，分離球蛋白，用鹽水(0．15mol／LNaCl)及緩沖液(0．5mol／LNaHC03—Na2C03，pH9．0)稀釋使每毫升內(nèi)含蛋白
8、質(zhì)lOmg，緩沖液為總量的10％，降溫至4℃。 ?、诩尤氘惲蚯杷猁}(FITC)熒光素[蛋白：熒光素＝(50—80)mg‘lmg]，在0～4℃ 下電磁攪拌12～14
