資源描述：
《賓美生物——藻藍(lán)蛋白的抗癌活性研究.docx》由會員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、藻藍(lán)蛋白的抗癌活性研究*摘 要:活細(xì)胞脫氫酶催化四唑鹽(MTT)還原,生成溶于有機(jī)溶劑的藍(lán)色甲月贊結(jié)晶,可定量反映細(xì)胞生長.流式細(xì)胞技術(shù)可根據(jù)細(xì)胞中DNA的質(zhì)量分?jǐn)?shù)來檢測其所處的細(xì)胞周期.采用上述兩種方法,研究了藻藍(lán)蛋白(PC)對HeLa細(xì)胞的抗癌活性.實(shí)驗(yàn)證明,PC對HeLa細(xì)胞生長有明顯的抑制作用,當(dāng)PC濃度為80mg/L時對癌細(xì)胞的抑制率達(dá)31.0%.初步認(rèn)為這種抑制機(jī)理為:PC使HeLa細(xì)胞由合成期(S)或分裂期(M)向G1期轉(zhuǎn)變和積集,細(xì)胞DNA合成衰減.關(guān)鍵詞:螺旋藻;藻藍(lán)蛋白;四唑鹽;流式細(xì)胞技術(shù);人子宮頸癌細(xì)胞(HeLa細(xì)胞)中圖分類號:Q17 文獻(xiàn)標(biāo)識碼:A 文章
2、編號:1008-973X(2001)06-0672-04螺旋藻(spirulina)的蛋白質(zhì)高達(dá)50%～70%,其中,藻藍(lán)蛋白(PC)占總蛋白的7%左右.PC具有特征性的吸收光譜和熒光光譜是一種新穎的熒光分子探針[1,2].隨著生物學(xué)、醫(yī)學(xué)、海洋藥物學(xué)等學(xué)科的發(fā)展,PC的生物活性已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn).飯島登等(1982)發(fā)現(xiàn)PC可提高淋巴細(xì)胞活性,增強(qiáng)機(jī)體抵抗力,繼而在1983年發(fā)現(xiàn)PC能維持和促進(jìn)正常受控細(xì)胞的功能,防止腫瘤的生長和復(fù)發(fā).抗腫瘤藥物的體外篩選,通常有染料排除法,軟瓊脂克隆法和[3H]胸腺嘧啶摻入法等[3].但這些方法準(zhǔn)確度較差,重復(fù)性低、操作復(fù)雜,實(shí)驗(yàn)周期長.本文
3、采用MTT法[4]和流式細(xì)胞技術(shù)對PC的抗癌活性進(jìn)行了研究.1 材料與方法1.1 實(shí)驗(yàn)材料HeLa細(xì)胞株(人子宮頸癌細(xì)胞),由浙江省腫瘤醫(yī)院提供.PC由浙江大學(xué)生物科學(xué)與技術(shù)系細(xì)胞實(shí)驗(yàn)室純化制備.1.2 主要試劑RPMI1640培養(yǎng)基(GifcoCo),胎牛血清(杭州四季青生物工程公司),胰蛋白酶trypsin(Difco進(jìn)口分裝),MTT(SigmaCo),二甲基亞砜DMSO(MerckCo),Tritonx-100(Sigma進(jìn)口分裝),RNaseA(Sigma),PI染料(Sigma)等。實(shí)驗(yàn)中所有藻藍(lán)蛋白由浙江賓美生物科技有限公司提供。1.3 溶液配制PBS液:每升溶液含N
4、aCl8.00g、kCl0.020g、Na2HPO4·H2O1.56g、KH2PO40.3g,15磅滅菌15min.Hanks液:每升溶液含NaCl18.40g、kCl0.40g、CaCl20.14g、MgSO4·7H2O0.2g、Na2HPO4·H2O0.06g、KH2PO40.06g,NaHCO30.35g,葡萄糖1.00g,酚紅0.02g,8磅滅菌20min.D-Hanks液:每升溶液含NaCl8.00g、kCl0.40gNa2HPO4·H2O0.06g、NaHCO30.35g、酚紅0.02g,8磅滅菌20min.Trypsin-EDTA液:Trypsin(Difco1:25
5、0)0.5g、EDTA0.2g,1000mLD-Hanks液,用NaOH調(diào)pH至7.5,超濾除菌.MTT液:用PBS深解成5g/L,超濾除菌,4℃避免保存.1.4 主要儀器CO2自動細(xì)胞培養(yǎng)箱(VWRModel1720,FormaCo.USA),酶標(biāo)儀(EIA-11,上海四達(dá)生物技術(shù)研究所),流式細(xì)胞儀(BectonDickinsonCo.USA),細(xì)胞培養(yǎng)瓶(25mL),96孔板,24孔板(華美公司).1.5 HeLa細(xì)胞的培養(yǎng)無菌條件下,將HeLa細(xì)胞放于RPMI1640+20%胎牛血清的培養(yǎng)基中,置于37℃,5%的CO2中培養(yǎng),細(xì)胞形成單層后進(jìn)行傳代培養(yǎng).1.6 MTT法檢沒
6、PC對HeLa細(xì)胞生長的抑制作用用Trysin-FDTA消化單層HeLa細(xì)胞,離心除去上清液,加培養(yǎng)液配成細(xì)胞懸液,并以1.0×105細(xì)胞孔接入96孔板.共設(shè)5組,每組8孔,每孔100LL.培養(yǎng)24h后,更換新鮮培養(yǎng)液.其中4組為實(shí)驗(yàn)組,每組每孔分別加入100LL質(zhì)量濃度為20、40、80、160mg/L的PC液,使PC最終作用質(zhì)量濃度分別為10、20、40、80mg/L.另一組為空白對照組,每孔加100LLPBS.于37℃培養(yǎng)72h后,加入MTT液,20LL/孔,37℃溫育4h,棄培養(yǎng)液,加入DMSO或無水乙醇(100LL/孔),輕微振蕩使甲月贊結(jié)晶充分溶解,用酶標(biāo)儀在490nm
7、測定OD值,按下列公式計算抑制率:抑制率=1-實(shí)驗(yàn)組OD-對照組OD-×100%.以細(xì)胞濃度1.0×104、1.5×104、2.0×104、2.5×104、3.0×104個/孔,分別接入96孔板,每組8孔培養(yǎng)24h后,每孔加20LLMTT,用MTT法測各級490nmOD值,并與細(xì)胞密度對應(yīng)坐標(biāo)圖得出線性歸跡.1.7 流式細(xì)胞技術(shù)檢測PC對HeLa細(xì)胞的抗癌活性方法試驗(yàn)設(shè)4個組、每組3瓶,每瓶接入2mL(2×105cells/mL)的細(xì)胞懸液,置于37℃,5%CO2培養(yǎng)
