葡聚糖凝膠柱的使用方法

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1、葡聚糖凝膠柱的使用方法：(1)預(yù)處理稱取SephadexG-25（50－100目）約5g，加入蒸餾水100ml，置室溫下3h進(jìn)行溶脹。(2)裝柱凝膠層析柱的直徑與柱長之比一般為1:15。柱的底部用裝有細(xì)玻璃管的橡皮塞塞緊，用洗凈的玻璃絲（約200目尼龍布）墊底或購買類似規(guī)格的商品柱。然后將柱垂直安裝好，先加入1/3柱體積蒸餾水，接著將溶脹好的凝膠邊攪勻邊連續(xù)裝入，使它們在柱內(nèi)自然沉降。同時大開下口慢速流出蒸餾水。裝柱后的凝膠必須均勻，不能有氣泡或明顯條紋。否則，必須到出重裝，裝好后，用蒸餾水平衡2－3h即可加樣品分離。(3)加樣加樣前，首先把柱內(nèi)凝膠上面多余的蒸餾水放出，直

2、到柱內(nèi)液面與凝膠表面相齊（或留一極薄液層）為止。然后，由柱的上端加水解液2ml，注意不要讓溶液把凝膠沖松浮起，加完樣品后，打開下口緩慢放出液體至液面與凝膠面相齊，再用少量蒸餾水沖洗原來盛樣品的容器2－3次，待全部進(jìn)入層析柱后，即可進(jìn)行洗脫。(4)洗脫與收集洗脫時，用蒸餾水作洗脫劑，并且要連續(xù)不斷地進(jìn)行，使凝膠柱上端保持一定的液層，防止凝膠柱表面的液體流干。本實驗洗脫液流出的速度應(yīng)控制在0.8－1.0ml/min。洗脫液的收集采用分管連續(xù)順序收集，每管收集3ml，共收集10管。據(jù)經(jīng)驗，4或5號管核苷酸濃度最大，可作為層析鑒定的樣品液。但因?qū)游鲋L度的差異，管號會有變化，必要時

3、可用紫外檢測A260nm，找出濃度最大的管號。(5)凝膠的再生和回收凝膠柱使用一次后，必須反沖疏松一次，平衡后再使用。若使用數(shù)次，就需要再生處理。用0.1mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡，然后用蒸餾水洗至中性備用。若實驗完畢，將再生后的凝膠在布氏漏斗上用蒸餾水洗滌抽干，再用95%乙醇洗兩次，在60℃烘箱中烘干，回收保存。實驗五.葡聚糖凝膠層析【實驗?zāi)康摹?.掌握葡聚糖凝膠的特性及凝膠層析的原理。2．學(xué)習(xí)葡聚糖凝膠層析的基本操作技術(shù)?！緦嶒炘怼磕z層析又稱分子排阻層析或凝膠過濾，是以被分離物質(zhì)的分子量差異為基礎(chǔ)的一種層析分離技術(shù)，這一技術(shù)為純化蛋白質(zhì)等生

4、物大分子提供了一種非常溫和的分離方法。層析的固定相載體是凝膠顆粒，目前應(yīng)用較廣的是：具有各種孔徑范圍的葡聚糖凝膠（Sephadex）和瓊脂糖凝膠（Sepharose）。葡聚糖凝膠是由直鏈的葡聚糖分子和交聯(lián)劑3—氯1，2—環(huán)氧丙烷交聯(lián)而成的具有多孔網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)的高分子化合物。凝膠顆粒中網(wǎng)孔的大小可通過調(diào)節(jié)葡聚糖和交聯(lián)劑的比例來控制，交聯(lián)度越大，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)越緊密；交聯(lián)度越小，網(wǎng)孔結(jié)構(gòu)就越疏松，網(wǎng)孔的大小決定了被分離物質(zhì)能夠自由出入凝膠內(nèi)部的分子量范圍?？煞蛛x的分子量范圍從幾百到幾十萬不等。葡聚糖凝膠層析，是使待分離物質(zhì)通過葡聚糖凝膠層析柱，各個組分由于分子量不相同，在凝膠柱上受到的阻

5、滯作用不同，而在層析柱中以不同的速度移動。分子量大于允許進(jìn)入凝膠網(wǎng)孔范圍的物質(zhì)完全被凝膠排阻，不能進(jìn)入凝膠顆粒內(nèi)部，阻滯作用小，隨著溶劑在凝膠顆粒之間流動，因此流程短，而先流出層析柱；分子量小的物質(zhì)可完全進(jìn)入凝膠顆粒的網(wǎng)孔內(nèi)，阻滯作用大，流程延長，而最后從層析柱中流出。若被分離物的分子量介于完全排阻和完全進(jìn)入網(wǎng)孔物質(zhì)的分子量之間，則在兩者之間從柱中流出，由此就可以達(dá)到分離目的。本實驗以葡聚糖凝膠G—25作為固定相載體，來分離藍(lán)色葡聚糖—2000和溴酚藍(lán)。藍(lán)色葡聚糖—2000分子量接近2×106，而溴酚藍(lán)分子量為670，二者分子量相差較大，前者完全排阻，而后者則可完全進(jìn)入凝膠

6、顆粒網(wǎng)孔內(nèi)，二者通過層析柱的時間不同而分開?！緦嶒灢牧稀?.實驗器材層析柱(1×20cm)附有一小段乳膠管及螺旋夾；洗脫液瓶(帶下口的三角瓶，250m1)；試管及試管架；量筒10m1；721型分光光度計2.實驗試劑(1)Tris—醋酸緩沖液(pH7.0):取0.0lmol/LTris溶液(含0.1mol/LKCl)900ml，用濃醋酸調(diào)pH至7.0，加蒸餾水至1000m1。(2)溴酚藍(lán)溶液：稱取溴酚藍(lán)10毫克，溶于5毫升乙醇中，充分?jǐn)嚢枋蛊淙芙猓缓笾鸬渭尤隩ris—醋酸緩沖液(pH7.0)至溶液呈深藍(lán)色。(3)藍(lán)色葡聚糖—2000溶液：稱取藍(lán)色葡聚糖—200010毫克，溶

7、于2毫升Tris—醋酸緩沖液(pH7.0)中即成。(4)樣品溶液：取溴酚藍(lán)溶液0.1毫升，藍(lán)色葡聚糖—2000溶液0.5毫升混勻后為上柱樣品溶液。(5)葡聚糖凝膠G-25(Sephadex-G-25)【實驗操作】1.實驗?zāi)z的制備：商品凝膠是干燥的顆粒，使用時需經(jīng)溶脹處理，稱取4克葡聚糖凝膠G—25，加50毫升蒸餾水，攪拌均勻，在室溫溶脹6小時，或沸水浴溶脹2小時，一般采用后一種方法。再用傾瀉法除去凝膠上層水及細(xì)小顆粒，用蒸餾水反復(fù)洗滌幾次，再以緩沖溶液(pH7.0的Tris—醋酸溶液)洗滌2—3次，使pH和離子強(qiáng)