豬腦心肌炎病毒的分離鑒定及RT-LAMP快速檢測方法的建立.pdf

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1、豬腦心肌炎病毒的分離鑒定及RT-LAMP快速檢測方法的建立IsolationandIdentificationofPorcineEncephalomyocarditisVirusandDevelopmentofRapidDetectionbyaRT-LAMPMethod學(xué)位申請人：張嶺嶺指導(dǎo)教師：孫繼國教授學(xué)科專業(yè)：預(yù)防獸醫(yī)學(xué)學(xué)位類別：農(nóng)學(xué)碩士授予單位：；n-I：ig農(nóng)業(yè)大學(xué)答辯日期：二。一一年五月二十九日獨創(chuàng)性聲明本人聲明所呈交的學(xué)位論文是本人在導(dǎo)師指導(dǎo)下進行的研究工作及取得的研究成果。據(jù)我所知，除了文中特

2、別加以標(biāo)注和致謝的地方外，論文中不包含其他人已經(jīng)發(fā)表或撰寫過的研究成果，也不包含為獲得塑皇墾盎些太堂或其他教育機構(gòu)的學(xué)位或證書而使用過的材料。與我一同工作的同志對本研究所做的任何貢獻均已在論文中作了明確的說明并表示謝意。學(xué)位論文作者簽名：彩氈必t次簽字日期：2口ff年6月f日學(xué)位論文版權(quán)使用授權(quán)書本學(xué)位論文作者完全了解塑宴墾壅些盤堂有關(guān)保留、使用學(xué)位論文的規(guī)定，有權(quán)保留并向國家有關(guān)部門或機構(gòu)送交論文的復(fù)印件和磁盤，允許論文被查閱和借閱。本人授權(quán)塑芻墾壘些盤堂可以將學(xué)位論文的全部或部分內(nèi)容編入有關(guān)數(shù)據(jù)庫進行檢索

3、，可以采用影印、縮印或掃描等復(fù)制手段保存、匯編學(xué)位論文。(保密的學(xué)位論文在解密后適用本授權(quán)書)學(xué)位論文作者簽名：劾b騶銘導(dǎo)師簽名：勃切卿簽字日期：Do／／年占月f日簽字日期：a，／年夕月／日學(xué)位論文作者畢業(yè)后去向：工作單位：通訊地址：電話：郵編：摘要Illlqlll11111111111111111[11111111Y1897294腦心肌炎是由腦心肌炎病毒(encephalomyocarditisvirus，EMCV)引起的多種脊椎動物以腦炎、心肌炎、心肌周圍炎及繁殖障礙為主要臨床特征的急性人畜共患傳染病。臨

4、床上，腦心肌炎病毒感染最嚴(yán)重和最廣泛的動物是豬，可引起仔豬致死性心肌炎，造成急性死亡，死亡率最高可達100％；導(dǎo)致懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎、弱胎、木乃伊胎。人感染后可呈現(xiàn)輕度腦炎癥狀。腦心肌炎不僅給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大的經(jīng)濟損失，同時也危害著人類的健康。本研究對河北地區(qū)發(fā)病豬場疑似豬腦心肌炎病料進行大量采集并處理，接種到BHK-21細胞上進行病毒的分離培養(yǎng)，通過RT-PCR技術(shù)，序列測定，病毒感染力的測定及理化特性實驗進行鑒定。實驗結(jié)果：分離得到的病毒能夠在BHK-21細胞上生長，細胞出現(xiàn)圓縮、崩解等病變；RT-PCR

5、擴增結(jié)果得到286bp的目的片段，與預(yù)期的結(jié)果一致；序列測定分析結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果相同，其核酸序列及氨基酸序列與GenBank公布的其他EMCV毒株的序列同源性為100％；該株EMCV不耐酸，對氯仿和胰蛋白酶不敏感，不耐熱，該毒株在50℃，lh的條件下喪失活性。環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(100p．mediatedisothermalamplification，LAMP)通過具有鏈置換特性的BstDNA聚合酶完成靶序列的擴增，僅需恒溫就能擴增DNA，并可通過核酸染料染色觀察結(jié)果。對RNA病毒不需要單獨進行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)，可

6、以直接在同一反應(yīng)管中進行反轉(zhuǎn)錄和擴增(RT-LAMP)反應(yīng)。本研究將RT-LAMP技術(shù)用于EMCV的檢測中，根據(jù)GenBank公布的豬腦心肌炎病毒基因序列，對其進行序列比對篩選保守序列。最后針對GenBankX74312毒株的保守序列(6232bp-6441bp)篩選并驗證RT-LAMP特異性引物。引物合成后初步建立RT-LAMP反應(yīng)，對反應(yīng)結(jié)果用HinfI限制性內(nèi)切酶進行酶切鑒定，并對所建立的RT-LAMP反應(yīng)體系及條件進行優(yōu)化；對RT-LAMP方法的靈敏度和特異性以及重復(fù)性與穩(wěn)定性進行了檢驗。同時，分別用

7、本試驗建立的RT-PCR和RT-LAMP方法對36份提取的RNA樣品進行檢測。實驗結(jié)果表明，RT-LAMP最佳反應(yīng)溫度是63℃，反應(yīng)時間為50min；最佳反應(yīng)體系(251xL)為：內(nèi)引物(FIP和BIP)各2．5pL，外引物(F3和B3)各0．5“L，3uLdNTPs(2．5mM)，2．5lxLMgCl2(25mM)，2．5uL10×BstDNABuffer，1．5HLBstDNA聚合酶，2¨LRNA提取物和6兒DEPCH20；其敏感性是普通PCR的100倍；具有較高的特異性；具有很好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性。綜上

8、所述，本研究成功分離出豬腦心肌炎病毒，并命名為BD2株；并建立了一種靈敏度高、特異性好的EMCV-I盯．IAMP快速檢測方法。關(guān)鍵詞：豬腦心肌炎病毒；分離與鑒定；環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)；檢測IsolationandIdentificationofPorcineEncephalomyocarditisVirusandDevelopmentofRapidDetectionbyaRT-LAMPMethodAu