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《gateway重組技術(shù)講課講稿.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、Gateway基因克隆Gateway基因克隆是由Invitrogen公司在二十世紀(jì)九十年代末發(fā)明并應(yīng)用于分子生物學(xué)基因克隆的一項(xiàng)專利技術(shù)。該技術(shù)利用專有的重組序列使得DNA片段能夠更有效地被轉(zhuǎn)入質(zhì)粒當(dāng)中，可應(yīng)用于大片段的基因克隆，并且在保持正確閱讀框的前提下讓不同表達(dá)載體間的DNA轉(zhuǎn)移成為可能。這一技術(shù)在插入的目的DNA片段兩端整合attL1和attL2兩個(gè)側(cè)端重組序列，來(lái)構(gòu)建一個(gè)類似通道的結(jié)構(gòu)并稱之為“入門克隆”（GatewayEntryClone）。據(jù)Invitrogen宣稱Gateway技術(shù)使用99%有效且可
2、逆的一小組重組反應(yīng)，如此使得基因克隆不同于傳統(tǒng)的限制性內(nèi)切酶方法，避免了目的片段內(nèi)存在切點(diǎn)的問(wèn)題而使得大片段DNA保持其完整性，大大提高了克隆效率，常應(yīng)用于大規(guī)模的DNA片段整合進(jìn)同一種表達(dá)載體，因此又稱之為高通量基因克隆技術(shù)（GatewayCloningTechnology）。一、Gateway基因克隆的原理及機(jī)制Gateway被視為一種克隆操作平臺(tái)：把目的基因克隆到入門載體（EntryVector）后，就不用依賴限制性內(nèi)切酶，而靠載體上存在的特定重組位點(diǎn)和重組酶，高效、快速地將目的基因克隆到其它的受體載體（De
3、stinationVector，目的載體）上。Gateway的原理是建立在噬菌體DNA定點(diǎn)整合到細(xì)菌宿主基因組上。在噬菌體和細(xì)菌的整合因子（INF、Int）的作用下，lambda的attP位點(diǎn)和大腸桿菌基因組的attB位點(diǎn)可以發(fā)生定點(diǎn)重組，lambda噬菌體DNA整合到大腸桿菌的基因組DNA中，兩側(cè)產(chǎn)生兩個(gè)新位點(diǎn)：attL和attR。這是一個(gè)可逆的過(guò)程，如果在一個(gè)噬菌體編碼蛋白Xis和IHF、Int的共同介導(dǎo)下這兩個(gè)新位點(diǎn)可以再次重組回復(fù)為attB和attP位點(diǎn)，噬菌體從細(xì)菌基因組上裂解下來(lái)（見(jiàn)圖1）。這一過(guò)程的方
4、向是受控于兩個(gè)重要因素：存在的介導(dǎo)蛋白和重組位點(diǎn)。圖1、噬菌體位點(diǎn)專一性重組的機(jī)制在Gateway系統(tǒng)中,入門載體包含兩個(gè)重組位點(diǎn)序列attL1和attL2，大小均為100bp，中間夾著一個(gè)自殺基因——ccdB基因。由于ccdB基因的表達(dá)產(chǎn)物能抑制普通的E.coli生長(zhǎng)，在克隆時(shí)沒(méi)有切開(kāi)或者自身環(huán)化的載體在轉(zhuǎn)化時(shí)不能生長(zhǎng)。在構(gòu)建含目的基因的入門載體時(shí)必須切掉這個(gè)基因，接入目的基因。ccdB基因兩端可以選擇的酶切位點(diǎn)有限（2個(gè)），同時(shí)還必須考慮讀碼框架、啟動(dòng)子、終止密碼等問(wèn)題，因此Gateway系統(tǒng)提供了5種不同的入
5、門載體以供選擇。需要特別注意的是轉(zhuǎn)化用的菌株必須是不含F(xiàn)附加體的，因?yàn)樗磉_(dá)的一種產(chǎn)物能阻斷ccdB基因，影響篩選結(jié)果。同樣，目的載體（DestinationVector）也必須和Gateway系統(tǒng)配套，即目的載體的表達(dá)調(diào)控元件下游有兩個(gè)重組位點(diǎn)attR1和attR2，大小均為125bp，同樣也夾著一個(gè)ccdB自殺基因。?當(dāng)需要將目的基因從入門載體（EntryVector）轉(zhuǎn)移到目的載體（DestinationVector）時(shí)，只要將兩種質(zhì)?；旌希ň€性化能有效提高重組率），加入含有Int、IHF、Xis等重組因子的
6、LR重組酶混合物，attR2序列和attL2序列發(fā)生重組，生成一個(gè)融合質(zhì)粒。attL1序列再和attR1序列重組，融合質(zhì)粒分解為兩個(gè)新的質(zhì)粒，目的基因與原來(lái)位于目的載體上的自殺基因發(fā)生重組置換，得到一個(gè)帶目的基因的目的載體（生成新的重組位點(diǎn)attB1、B2）和帶自殺基因的入門載體（生成新的重組位點(diǎn)attP1、P2，見(jiàn)圖2）。由于帶自殺基因的載體不能生長(zhǎng)，加上抗生素篩選，轉(zhuǎn)化產(chǎn)物重組率高達(dá)90%以上。圖2、gateway機(jī)制由于在這個(gè)反應(yīng)中attL1序列只和attR1序列重組，attL2序列只能與attR2序列重組，
7、這個(gè)方向的反應(yīng)稱為L(zhǎng)R反應(yīng)。LR反應(yīng)生成新的位點(diǎn)稱為attP1/2（200bp）和attB1/2（25bp）序列。在一定的條件下，attP和attB序列也能發(fā)生重組，生成attL和attR序列，這個(gè)反向反應(yīng)稱為BP反應(yīng)（見(jiàn)圖3）[1]。圖3、BP反應(yīng)及LR反應(yīng)?當(dāng)用戶得到一個(gè)含目的基因的Gateway表達(dá)載體，希望將目的基因轉(zhuǎn)移到另外幾個(gè)Gateway表達(dá)載體中時(shí)，只要先將目的基因從Gateway表達(dá)載體中轉(zhuǎn)移到入門載體上，在由入門載體轉(zhuǎn)移到其它的表達(dá)載體就行。將含目的基因的Gateway表達(dá)載體（attB1—目的
8、基因—attB2序列）與帶有attP1-ccdB(自殺基因)-attP2序列的供體載體（pDONR，注意這個(gè)載體不同于入門載體EntryVector）混合，加入含有Int、IHF的BP重組酶混合物，attP和attB序列也能發(fā)生重組，生成帶有目的基因的入門載體（EntryVector）和帶自殺基因的表達(dá)載體。同樣，由于抗性不同以及自殺基因的作用，只有含目的基
