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1、鯉魚(yú)嗜水氣單胞菌的檢測(cè)與分析 摘要：對(duì)從漁場(chǎng)采集患細(xì)菌性敗血癥的瀕死鯉魚(yú)進(jìn)行細(xì)菌分離培養(yǎng)及毒力因子測(cè)試，應(yīng)用鍍銀染色、負(fù)染色技術(shù)檢測(cè)菌體。根據(jù)細(xì)菌的致病力，形態(tài)特征及鞭毛生長(zhǎng)位置、數(shù)目、長(zhǎng)短等指標(biāo)，判斷其菌體。結(jié)果表明，分離的菌體無(wú)雜菌生長(zhǎng)，嗜水氣單胞菌是鯉魚(yú)敗血癥的致病菌?！ ￡P(guān)鍵詞：鯉魚(yú)；嗜水氣單胞菌；毒力因子；菌體；檢測(cè)與分析 中圖分類號(hào)：Ｓ９１７．１文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：Ａ文章編號(hào)：0439－８11403－0564-02 ＤｅｔｅｃｔｉｏｎａｎｄAｎａｌｙｓｉｓｏｆＣａｒｐAｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ ?。冢龋粒危?/p>
2、Ｗｅｎ－ｌｉa，ＺＨAＮＧＹｕ－ｆｅｎb，ＺＨＡＮＧＸｉｕ－ｊｕｎb ?。粒猓螅簦颍幔悖簦海疲椋螅瑁悖铮欤欤澹悖簦澹洌妫颍铮恚妫椋螅瑁椋睿纾纾颍铮酰睿洌洌椋睿纾铮妫猓幔悖簦澹颍椋幔欤螅澹穑簦椋悖澹恚椋幔鳎澹颍澹椋螅铮欤幔簦澹洌幔睿鋡ereproceededｂａｃｔｅｒｉａculturing，ｖｉｒｕｌｅｎｃｅｆａｃｔｏｒｓtesting，ｗｉｔｈａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｏｆｓｉｌｖｅｒｓｔａｉｎｉｎｇ，ｎｅｇａｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆbacterium．Ｔｈｅstrainｗａｓｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄａｃ
3、ｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｂａｃｔｅｒｉａｌｖｉｒｕｌｅｎｃｅ，ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙａｎｄｆｌａｇｅｌｌａｒ’sｇｒｏｗｔｈｐｏｓｉｔｉｏｎ，ｎｕｍｂｅｒ，ｌｅｎｇｔｈａｎｄｏｔｈｅｒｉｎｄｉｃａｔｏｒｓ．Ｔｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔ，ｔｈｅｓｅｐａｒａｔｅｄbacteriumｇｒｏｗedｗｉｔｈｏｕｔｏｔｈｅｒbacterium，ａｎｄＡｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａwasｔｈｅpathogenｏｆａｃａｒｐｓｅｐｔｉｃｅｍｉａ． ?。耍澹鳎铮颍洌螅篶arp；Ａｅｒｏｍｏｎａｓｈｙｄｒｏｐｈｉｌａ；ｖｉｒｕｌｅｎｃｅ
4、ｆａｃｔｏｒｓ；ｔｈａｌｌｕｓ；ｄｅｔｅｃｔｉｏｎandanalysis 近年來(lái)，隨著高密度養(yǎng)殖和環(huán)境污染等原因，各種魚(yú)類疾病發(fā)病率大大增加，其中細(xì)菌性敗血癥是鯉魚(yú)的嚴(yán)重病害之一。感染細(xì)菌性敗血癥的病魚(yú)或死魚(yú)主要癥狀為兩眼突出，腹部膨大，體表有大小不等的紅斑，肛門(mén)紅腫，尾鰭潰爛。少數(shù)病變嚴(yán)重的鯉魚(yú)用手觸摸體表，鱗片即脫落。剖檢病魚(yú)可發(fā)現(xiàn)魚(yú)鰓為暗紅色，肝臟腫大，大部分呈土黃色，膽囊高度充盈，脾臟呈暗黑色，腹腔有淡紅色腹水，黏膜變黑。試驗(yàn)擬找出鯉魚(yú)細(xì)菌性敗血癥的病原菌，通過(guò)無(wú)菌細(xì)菌培養(yǎng)及毒力因子測(cè)試，判斷菌體形態(tài)特征、菌體表面結(jié)構(gòu)與鞭
5、毛形成情況等，為細(xì)菌的分類提供檢測(cè)技術(shù)及基礎(chǔ)資料?！ 。辈牧吓c方法 ?。保辈牧稀 。保保被疾□庺~(yú)患病鯉魚(yú)采集于唐山市豐南養(yǎng)殖場(chǎng)?！ 。保保才囵B(yǎng)基及細(xì)菌鑒定條營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基、瓊脂斜面培養(yǎng)基、營(yíng)養(yǎng)肉湯、血瓊脂平板、脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板，參照說(shuō)明制備使用；ＡＰＩ細(xì)菌鑒定條由法國(guó)梅里埃公司提供?！ 。保保硟x器日本ＯＬＹＭＰＵＳ公司ＣＨＣ－２１２型光學(xué)顯微鏡；日本日立Ｈ－７６５０型透射電子顯微鏡?！ 。保卜椒ā 。保玻奔?xì)菌分離培養(yǎng)無(wú)菌采取發(fā)病或?yàn)l死鯉魚(yú)的肝、脾、腎，劃線接種于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，２８℃培養(yǎng)２４ｈ，挑取單
6、個(gè)菌落獲純培養(yǎng)物后，轉(zhuǎn)接于普通營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，然后移接于營(yíng)養(yǎng)肉湯試管，置搖床培養(yǎng)１６ｈ，涂片，供鞭毛鍍銀染色。取營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上菌體，２８℃培養(yǎng)１６～１８ｈ，制成菌懸液，濃度為１．０×１０８CFU／ｍＬ，用于磷鎢酸負(fù)染色?！ 。保玻捕玖σ蜃訖z測(cè)將分離的菌株接種于血瓊脂平板上，２８℃培養(yǎng)２４ｈ，觀察溶血情況并挑取單個(gè)菌落接種于含１．５％脫脂奶蔗糖胰蛋白胨瓊脂平板上，２８℃培養(yǎng)２４ｈ，以在點(diǎn)種菌生長(zhǎng)菌落周圍出現(xiàn)清晰溶蛋白圈者為陽(yáng)性?！ 。保玻臣?xì)菌生化鑒定經(jīng)ＡＰＩ細(xì)菌鑒定條鑒定此菌為嗜水氣單胞菌。 ?。保玻幢廾冦y染色取
7、鞭毛染色液Ａ液０．１ｍＬ加入有塞的試管內(nèi)，再加入Ｂ液０．１ｍＬ充分混合［１，２］，用酒精燈火焰輕微緩緩加熱１０～２０ｓ，稍冷卻。這樣處理過(guò)的混合液染片４０ｓ即可，去離子水緩慢沖洗干凈。Ａ、Ｂ液混合物不穩(wěn)定，加熱１０ｍｉｎ內(nèi)使用。滴加銀染液Ｃ液染色，加熱至微冒蒸氣，染色１０～２０ｓ，去離子水洗凈染液，干后鏡檢?！ 。保玻祽业畏ㄘ?fù)染色采用２％磷鎢酸［３］水溶液，，選用日本進(jìn)口３００目銅網(wǎng)，制成Ｆｏｒｍａｌ支持膜，厚度１００～２００??。備好試驗(yàn)操作用無(wú)菌帶蓋玻璃平皿，用１ｍＬ注射器抽取０．１～０．２ｍＬ菌懸液；小心滴于帶有Ｆｏｒｍａｌ膜
8、的銅網(wǎng)上；靜置２ｍｉｎ，用小片濾紙吸取銅網(wǎng)邊緣余液，再靜置２ｍｉｎ。用１ｍＬ注射器抽?。埃薄埃玻恚倘疽?，滴加染液于帶菌體的銅網(wǎng)上，靜置１～２ｍｉｎ，小片濾紙吸去銅網(wǎng)邊緣染液。自然干燥或距離普通臺(tái)燈１５
