基因組測(cè)序與序列組裝.ppt

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1、第二講基因組測(cè)序與序列組裝主要內(nèi)容:什么是基因組什么是基因DNA測(cè)序的方法DNA序列的組裝人類基因組計(jì)劃水稻基因組計(jì)劃后基因組學(xué)1.什么是基因組基因組就是一個(gè)物種中所有基因的整體組成?；蚪M有兩層意義：遺傳物質(zhì)和遺傳信息。要揭開(kāi)生命的奧秘，就需要從整體水平研究基因的存在、基因的結(jié)構(gòu)與功能、基因之間的相互關(guān)系。Zeamays8,000Homosapiens3,000Oryzasativa400Drosophilamelanogaster165Arabidopsisthaliana100Saccharomycescerevisiae

2、12E.coli4.6GenomeSize(Mb)什么是C值？通常是指一種生物單倍體基因組DNA的總量.在真核生物中，C值一般隨著生物的進(jìn)化而增加，高等生物C值一般大于低等生物。C值悖理：生物的復(fù)雜性與基因組的大小并不完全成比例增加細(xì)菌真菌等動(dòng)物陰影部分為一個(gè)門(mén)內(nèi)C-值的范圍重復(fù)順序高度重復(fù)順序：長(zhǎng)度：幾個(gè)——幾千個(gè)bp拷貝數(shù)：幾百個(gè)——上百萬(wàn)個(gè)首尾相連，串聯(lián)排列集中分布于染色體的特定區(qū)段（如端粒，著絲粒等）也稱衛(wèi)星DNA中度重復(fù)順序：一般分散于整個(gè)基因組中；長(zhǎng)度和拷貝數(shù)差別很大單一順序：基因主要位于單一順序動(dòng)物中單一順序約占5

3、0％植物中單一順序約占20％是遺傳信息的物理和功能單位，包含產(chǎn)生一條多肽鏈或功能RNA所必需的全部核苷酸序列。基因分類：編碼RNA的基因，如rRNA基因，snRNA基因等；編碼蛋白質(zhì)的基因2.什么是基因？基因的不連續(xù)性Intron和Exon:大多數(shù)真核生物蛋白質(zhì)基因的編碼順序(Exon)都被或長(zhǎng)或短的非編碼順序(Intron)隔開(kāi)基因家族一群具有一致的或相似順序的基因,有的還擔(dān)負(fù)類似的生物學(xué)功能,可以相互補(bǔ)償,比如:E2ftranscriptionfactorMousesymbolHumanOrthologE2f1E2F1E2f

4、2E2F2E2f3E2F3E2f4E2F4E2f5E2F5E2f6E2F6假基因(Pseudogene)來(lái)源于功能基因但已失去活性的DNA序列產(chǎn)生假基因的原因有:由重復(fù)產(chǎn)生的假基因;加工的假基因,由RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA后再整合到基因組中;殘缺的基因(Truncatedgene)重疊基因:同一段DNA能攜帶兩種不同蛋白的信息.重迭基因有以下幾種情況：*一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部*部分重疊*兩個(gè)基因共用少數(shù)堿基對(duì)*一個(gè)基因完全在另一個(gè)基因內(nèi)部如：B和A，E和D其讀碼結(jié)構(gòu)互不相同---ATG-----//------AATGCC-

5、---//---ATAACG---//--TAA----A*BATGCCN----NNATAA*部分重疊如：K和C*兩個(gè)基因共用少數(shù)堿基對(duì)如：D和J-------TAATG-------D終止密碼子J起始密碼子3.DNA測(cè)序的方法鏈終止法測(cè)序化學(xué)降解法測(cè)序自動(dòng)化測(cè)序非常規(guī)DNA測(cè)序3.1鏈終止法測(cè)序(thechainterminationmethod)基本原理:通過(guò)合成與單鏈DNA互補(bǔ)的多核苷酸鏈，由于合成的互補(bǔ)鏈可在不同位置隨機(jī)終止反應(yīng)，產(chǎn)生只差一個(gè)核苷酸的DNA分子，從而來(lái)讀取待測(cè)DNA分子的順序。技術(shù)路線與要求制備單鏈模板

6、↓將單鏈模板與一小段引物退火↓加入DNA多聚酶4種脫氧核苷酸分別加入少量4種雙脫氧核苷酸↓將4種反應(yīng)產(chǎn)物分別在4條泳道電泳↓根據(jù)4個(gè)堿基在4條泳道的終止位置讀出基因序列A克隆于質(zhì)粒中DNA→用堿或熱變性BM13克隆單鏈DNAC噬?？寺NADPCR產(chǎn)生單鏈DNAA高酶活性B無(wú)5’→3′外切酶活性C無(wú)3′→5′外切酶活性ddATP/ddCTP/ddGTP/ddTTP的3’碳原子連接的是氫原子,不是羥基3.2化學(xué)降解法測(cè)序基本原理:在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)基團(tuán)，再用化合物處理，使DNA分子在被修飾的位置降解。技術(shù)路線將雙鏈DNA

7、樣品變?yōu)閱捂湣總€(gè)單鏈的同一方向末端都用放射性同位素標(biāo)記，以便顯示DNA條帶↓分別用不同方法處理，獲得只差一個(gè)核苷酸的降解DNA群體↓電泳，讀取DNA的核苷酸順序Maxam-Gilbert法所用的化學(xué)技術(shù)堿基特異修飾方法GPh8.0,用硫酸二甲酯對(duì)N7進(jìn)行甲基化,使C8-C9鍵對(duì)堿基裂解有特殊敏感性A+GpH2.0哌啶甲酸可使嘌呤環(huán)的N原子化,從而導(dǎo)致脫嘌呤,并因此消弱腺嘌呤和鳥(niǎo)嘌呤的糖苷鍵C+T肼可打開(kāi)嘧啶環(huán),后者重新環(huán)化成五元環(huán)后易除去C1.5mol/LNaCl存在時(shí),可用肼除去胞嘧啶化學(xué)法測(cè)序?qū)嵗哙?.3自動(dòng)化測(cè)序基本原

8、理與鏈終止法測(cè)序原理相同,只是用不同的熒光色彩標(biāo)記ddNTP,如ddATP標(biāo)記紅色熒光,ddCTP標(biāo)記藍(lán)色熒光,ddGTP標(biāo)記黃色熒光,ddTTP標(biāo)記綠色熒光.由于每種ddNTP帶有各自特定的熒光顏色,而簡(jiǎn)化為由1個(gè)泳道同時(shí)判讀4種堿基.3.4非常規(guī)測(cè)序毛細(xì)管電