基因組學(xué) 課件 4基因組測序與序列組裝.ppt

《基因組學(xué) 課件 4基因組測序與序列組裝.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。

1、基因組測序與序列組裝中英聯(lián)合實驗室中英聯(lián)合實驗室基因組測序與序列組裝基因組計劃的最終目標(biāo)是獲得所研究的生物的完整的DNA順序。最佳狀況是將物理圖譜和遺傳圖譜進行有機整合，以確定基因以及其他重要的序列在DNA順序中的位置。主要內(nèi)容：1.DNA測序的方法2.DNA序列的組裝3.基因組測序的其他路線4.人類基因組的測序和組裝中英聯(lián)合實驗室4.1DNA測序的方法DNA測序技術(shù)主要有兩種方法，都是在20世紀(jì)70年代中期發(fā)明的。A.雙脫氧鏈終止法（thechainterminationmethod），是通過合成與單鏈DNA互補的

2、多核苷酸鏈來讀取待測DNA分子的順序。B.化學(xué)降解法（chemicaldegradationmethod），是將雙鏈DNA分子用化學(xué)試劑處理，產(chǎn)生切口，用同位素標(biāo)記進行測序。中英聯(lián)合實驗室A.雙脫氧鏈終止法原理：DNA復(fù)制：模板DNA、DNA聚合酶、引物、4種dNTPddNTP的加入：在反應(yīng)系統(tǒng)中加入雙脫氧（堿基）核苷三磷酸（ddNTP），只要雙脫氧核苷酸摻入3’端，該鏈就停止延伸，鏈端摻入單脫氧核苷酸的片段可繼續(xù)延伸。如此得到3’端終止于ddNTP的一系列長度不等的核酸片段4個反應(yīng)體系中分別加入4種不同的ddNTP

3、，濃度低于dNTP。反應(yīng)終止后，分四個泳道進行電泳（聚丙烯酰胺凝膠），分離長短不一的核酸片段(長度相鄰者僅差一個堿基)，根據(jù)片段3’端的雙脫氧堿基，可依次閱讀合成片段的堿基排列順序。中英聯(lián)合實驗室A.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法測序的原理中英聯(lián)合實驗室A.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法對DNA多聚酶的要求：高酶活性無5’－3’外切核酸酶活性，5’－3’外切核酸酶使DNA聚合酶去除已存在的鏈無3’－5’外切核酸酶活性，3’－5’外切核酸酶使DNA聚合酶校正自身錯誤天然的DNA聚合酶不能滿足，需要進行改造Klenow聚合酶

4、：來自大腸桿菌DNA聚合酶Ⅰ，外切酶活性去除，酶活性不夠，250bp測序酶Sequenase：噬菌體T7編碼中英聯(lián)合實驗室A.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法要求單鏈作為模板：將DNA克隆到質(zhì)粒載體中：堿變性或熱變性變?yōu)閱捂?，雙向測序；污染，干擾以M13載體克隆單鏈DNA：無需變性，直接測序；>3kb，擴增時容易發(fā)生丟失與重排，小片段DNA測序以噬菌粒（phagemid）克隆DNA：改造的質(zhì)粒載體，2個復(fù)制起始點（質(zhì)粒自身和M13單鏈?zhǔn)删w），在大腸桿菌細胞中產(chǎn)生單鏈?zhǔn)删＃?10kbDNA測序PCR產(chǎn)生單鏈DNAPCR

5、制備單鏈DNA中英聯(lián)合實驗室A.雙脫氧鏈終止法通過M13載體獲得單鏈DNA以測序：是利用M13噬菌體在體外能以單鏈形式存在。將待測序DNA片段連接到M13載體中去，再利用引物，進行DNA合成，并在合成系統(tǒng)中加入ddNTP中英聯(lián)合實驗室A.雙脫氧鏈終止法雙脫氧鏈終止法中引物的影響：引物決定了模板鏈的測序起點，一般來說，是采用克隆位點附近載體上的一段順序。A.通用引物：與載體DNA中附近插入片段的順序退火，可引入新鏈的合成。B.內(nèi)部引物：提供一系列端部以及內(nèi)部可完成長序列順序的克隆。中英聯(lián)合實驗室B.化學(xué)降解法基本原理：

6、在選定的核苷酸堿基中引入化學(xué)基團，再用哌啶處理使DNA分子在被修飾的核苷酸位置降解。同時完成4組反應(yīng)，A、G、C、T鏈終止法：主流技術(shù)，易于機械化自動控制化學(xué)降解法：試劑含有毒性主要原因是鏈終止法。測序技術(shù)的發(fā)展放射性同位素標(biāo)記底物：靈敏度高熒光標(biāo)記物：靈敏度與分辨力，便于儀器閱讀。一種堿基一種顏色（A紅色，G黃色，C藍色，T綠色）毛細管電泳：取代聚丙烯凝膠平板電泳，96個泳道，每次可同時進行96次測序，每輪實驗不到2小時，1天可完成近千次反應(yīng)光點測序pyrosequencing：無須電泳，每連接dNTP時釋放1個焦

7、磷酸，焦磷酸在磷酸化酶的作用下轉(zhuǎn)換為化學(xué)能，發(fā)出光亮。每次只加入1種dNTPDNA芯片測序：將各種排列順序的寡聚核苷酸點在芯片上，DNA分子與芯片溫浴，能雜交的寡聚核苷酸都會在確定位置發(fā)出信號，獲取信息進行對比組裝。中英聯(lián)合實驗室最新進展：經(jīng)濟快捷的DNA染色測序法2005年4月，美國columbia大學(xué)的科學(xué)家給4種堿基染上不同的顏色，然后從人類p53基因中抽取一個由12個堿基組成的片段，運用分子生物學(xué)技術(shù)使染色的堿基排列成與該DNA片段互補的一個新片段。傳統(tǒng)DNA測序的方法有毛細管微陣列電泳測序和焦磷酸測序等，這

8、些方法技術(shù)要求較高、成本昂貴，而且容易出錯。相比而言，新方法通過逐個觀察DNA片段上堿基的顏色來確定其序列，精確度極高。對這項研究提供資助的美國國家人類基因組研究所希望，在10年內(nèi)將哺乳動物的基因測序成本從1000萬美元降低到1000美元，這樣就有可能以廉價的成本對患者進行“量身定做”的基因治療。中英聯(lián)合實驗室4.2DNA序列的組裝將大量短的D