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《一站式免疫印跡western blot套裝.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、技術(shù)咨詢電話：400-607-9999一站式免疫印跡westernblot套裝One-StopWesternBlottingPack貨號(hào):P030076產(chǎn)品及特點(diǎn)WesternBlot是檢測(cè)固定在固相基質(zhì)上的蛋白質(zhì)的免疫方法，又叫免疫印跡（immunoblotting）。該方法的是先將蛋白質(zhì)從凝膠中轉(zhuǎn)移到固相基質(zhì)（硝酸纖維素膜）上；再對(duì)其進(jìn)行特異性抗體檢測(cè)。由于涉及多種溶液，用戶單獨(dú)配制的話十分繁瑣，為此本公司開發(fā)了本產(chǎn)品。它具有下列特點(diǎn):1.一站式，提供除水、樣品和抗體以外的所有成分（檢測(cè)方法有HRP或AP檢測(cè)法兩種）。2.即開即用，用戶不需單獨(dú)準(zhǔn)備各種成分，十分方
2、便。3.靈敏，可檢測(cè)10pg的蛋白質(zhì)（HRP或AP檢測(cè)法）。4.靈活，與SDS-PAGE、非變性PAGE膠、等電聚焦電泳等兼容。規(guī)格及成分成份A型Western轉(zhuǎn)移液20L（干粉）硝酸纖維素膜（0.22μm）20張Western封膜液0.2LWestern洗膜液0.2LWestern抗體稀釋液0.2L熱封塑料袋20個(gè)HRP顯色試劑20次AP顯色試劑-使用手冊(cè)1份注意：本制品僅供研究使用，請(qǐng)勿用于臨床治療等其他用途技術(shù)咨詢電話：400-607-9999運(yùn)輸及保存常溫運(yùn)輸，4℃保存，有效期一年。使用方法一：轉(zhuǎn)膜（濕法轉(zhuǎn)移）1.制備1LWestern轉(zhuǎn)移液并冷卻到4℃。本產(chǎn)
3、品以干粉形式提供，溶解在適量水中即得20×濃縮轉(zhuǎn)移液(水的具體用量取決于是5L還是20L的包裝),用時(shí)再用去離子水新鮮稀釋20倍使用。2.根據(jù)凝膠的大小剪切同樣大小的濾紙和各邊都大1mm的硝酸纖維素膜。剪切時(shí)一定要戴手套，因?yàn)槭稚系牡鞍讜?huì)污染硝酸纖維素膜。3.將切好的硝酸纖維素膜浸泡在Western轉(zhuǎn)移液中15-20分鐘備用。注意：最好用鑷子夾住膜的一邊輕輕置于Western轉(zhuǎn)移液上，使膜漂浮在轉(zhuǎn)移液上，只有下層才與轉(zhuǎn)移液接觸，這樣由于毛細(xì)管作用可使整個(gè)膜浸濕。若膜沉入轉(zhuǎn)移液里，膜與轉(zhuǎn)移液之間形成一層空氣膜，這樣會(huì)阻止膜與轉(zhuǎn)移液接觸。4.在容器中將兩塊海綿墊、六層濾紙
4、用轉(zhuǎn)移液浸濕。5.在轉(zhuǎn)移夾上依次放上一張浸濕的海綿墊、三層浸濕的濾紙、一塊凝膠（只要分離膠部分）、一張浸濕的硝酸纖維素膜、三層浸濕的濾紙、一張浸濕的海綿墊。注意：每疊加層一定要用玻棒來(lái)回?fù){幾遍以搟走里面的氣泡。膜兩邊的濾紙絕對(duì)不能相互接觸，否則電轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)發(fā)生短路，燒壞轉(zhuǎn)膜裝置。6.合起轉(zhuǎn)移夾并放入轉(zhuǎn)移槽中（一定要注意方向，轉(zhuǎn)印帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)時(shí)電極方向是膜正膠負(fù)；轉(zhuǎn)印帶正電荷的蛋白質(zhì)時(shí)，電極方向是膜負(fù)膠正），然后用在第一步預(yù)冷的轉(zhuǎn)移液灌滿轉(zhuǎn)移槽。7.插上電極，一般在冷卻條件下用100V恒壓轉(zhuǎn)移30-60分鐘或冷室中14V轉(zhuǎn)移過夜。注意：一定要檢查電流的大小，電流一般在
5、0.1-0.4A。應(yīng)根據(jù)蛋白分子量的大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間，對(duì)于小分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)最好墊兩塊硝酸纖維素膜，即使白質(zhì)已經(jīng)轉(zhuǎn)過了第一張膜，還會(huì)在第二張膜上檢測(cè)到；對(duì)于大分子量的蛋白，轉(zhuǎn)膜時(shí)電壓要高一點(diǎn)，時(shí)間也要延長(zhǎng)一點(diǎn)，開始最好也用兩塊膜。轉(zhuǎn)移時(shí)間長(zhǎng)的時(shí)候特別要注意加強(qiáng)降溫措施。如果目的蛋白轉(zhuǎn)移效率低，可以在轉(zhuǎn)移液中加20%甲醇或0.1%的SDS。注意：本制品僅供研究使用，請(qǐng)勿用于臨床治療等其他用途技術(shù)咨詢電話：400-607-99991.終止轉(zhuǎn)移后，取出膜，并在膜上剪去一個(gè)小角以標(biāo)記方向。可用各種染膜液對(duì)膠或膜進(jìn)行染色以確定蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移效率，或省略此步直接進(jìn)入封膜步驟。二：
6、封膜1.將膜轉(zhuǎn)移至可以熱密封的塑料袋中，加5-10mLWestern封膜液，熱密封塑料袋。2.室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉30-60分鐘。注意：此封膜液只適用于硝酸纖維素膜和PVDF膜，不能用于尼龍膜。三：一抗結(jié)合1.用抗體稀釋液將一抗稀釋至適當(dāng)濃度。一般稀釋10-100，000倍。2.打熱密封的塑料袋的一角，倒去封膜液，加入5mL一抗溶液，熱密封塑料袋。3.室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉30-60分鐘。四：二抗結(jié)合1.用抗體稀釋液將二抗稀釋至適當(dāng)濃度，一般稀釋500-4000倍。多余抗體可分裝后放-20℃長(zhǎng)期保存。2.打熱密封的塑料袋的一角，倒去封膜液，加入5mL二抗溶液，熱
7、密封塑料袋。3.室溫下脫色搖床上搖動(dòng)封閉30-60分鐘。過夜孵育可以提高靈敏度。4.用洗膜液在容器中洗膜3次，每次10分鐘。5.根據(jù)二抗的標(biāo)記物選擇下面兩種顯色方法之一。五：HRP顯色檢測(cè)（如果二抗是用HRP標(biāo)記）1.新鮮配制HRP顯色液：將1mLHRP顯色試劑溶液A、10mLHRP顯色試劑溶液B、39mL洗膜液和33uLHRP顯色試劑溶液C混合。2.將硝酸纖維素膜轉(zhuǎn)移到顯色液中，搖晃5-30分鐘顯色。3.顯色后用水洗膜以終止顯色反應(yīng)，每次30分鐘，共三次。4.用吸水紙吸干膜上的水分，避光干燥保存或在一周內(nèi)照相。注意：本制品僅供研究使用，請(qǐng)勿用于臨床
