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《蛋白免疫印跡法western-blot-原理及步驟上課講義.ppt》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、蛋白免疫印跡法Western-blot-原理及步驟SDS-PAGE原理SDS-PAGE：是在蛋白質(zhì)樣品中加入SDS和含有巰基乙醇的樣品處理液，SDS是一種很強(qiáng)的陰離子表面活性劑，它可以斷開分子內(nèi)和分子間的氫鍵，破壞蛋白質(zhì)分子的二級(jí)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。強(qiáng)還原劑巰基乙醇等可以斷開二硫鍵破壞蛋白質(zhì)的四級(jí)結(jié)構(gòu)。使蛋白質(zhì)分子被解聚成肽鏈形成單鏈分子。解聚后的側(cè)鏈與SDS充分結(jié)合形成帶負(fù)電荷的蛋白質(zhì)-SDS復(fù)合物蛋白質(zhì)分子結(jié)合SDS陰離子后，所帶負(fù)電荷的量遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過了它原有的凈電荷，從而消除了不同種蛋白質(zhì)之間所帶凈電荷的差異。蛋白質(zhì)的電泳遷
2、移率主要決定于亞基的相對(duì)分子質(zhì)量，而與其所帶電荷的性質(zhì)無關(guān)。Westernblot內(nèi)容蛋白樣品的制備SDS-PAGE轉(zhuǎn)膜封閉一抗雜交二抗雜交底物顯色步驟蛋白樣品的制備1，在冰上收細(xì)胞，用PBS清洗兩次，洗去培養(yǎng)基。1500r,5min離心，棄去上清液。2，裂解細(xì)胞（裂解液:PI:PMSF=100:1:1）,根據(jù)所需蛋白濃度加細(xì)胞裂解液?；靹?。于冰上裂解20min。3，14000r,10min離心。上清液即為所需蛋白樣品液。4，用Bradford蛋白分析法測(cè)蛋白濃度。5，按100ul裂解液加30ul的6X的loading
3、buffer的比例，向蛋白樣品液中添加loadingbuffer。6，于95℃，5min條件下對(duì)蛋白樣品進(jìn)行高溫變性。SDS-PAGE:1，灌膠：（1）保證玻璃板干燥潔凈，玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。（2）配好分離膠，加入TEMED，混勻后即可灌膠。灌膠過程中膠要沿著玻璃板流下，防止有氣泡產(chǎn)生。將膠灌至接近綠帶中線即可。（3）用去離子水進(jìn)行液封，膠凝速度會(huì)更快（加水時(shí)速度要慢，防止膠被沖變形）（4）待水與膠之間有一條折射線的時(shí)，說明膠已經(jīng)凝固。此時(shí)，可完全除去膠上層的水。（5）配制濃縮膠，加入TE
4、MED,混勻后將剩余空間灌滿濃縮膠。然后插入梳子。待濃縮膠凝固后小心拔出梳子。（6）用水沖洗一下膠板，裝入電泳槽中（小玻板面向內(nèi)，大玻板向外；若只跑一塊板，槽的另一邊要放一塊塑料板，有字的一面向外）2，電泳向電解槽中加入適量的RunningBuffer,將蛋白樣品以50ug的標(biāo)準(zhǔn)換算出的體積進(jìn)行上樣。以電壓120V或160V進(jìn)行電泳，電泳至前沿跑至最底端即可進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜用硝酸纖維素膜（NC膜），進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。組裝轉(zhuǎn)膜“三明治”的過程在Transferbuffer中進(jìn)行：黑的一面在下，依次放上濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，然后
5、合上三明治。整個(gè)過程必須保證無氣泡。接著把轉(zhuǎn)膜“三明治”放入轉(zhuǎn)膜槽中，注意正負(fù)極放置正確。倒入適量的Transferbuffer。在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件：120V,1.5h或者150V，1h封閉轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC膜，按照所需蛋白的位置，裁剪NC膜。使其浸潤于封閉液中，緩慢搖蕩1h一抗雜交封閉過后，把NC膜放入塑料袋中，按膜的大小加入適量的一抗溶液（一抗：封閉液=1:1000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育4h。二抗雜交一抗孵育完成后，取出NC膜，交替加入TBST和TBS進(jìn)行洗膜，一共洗三次，每次7~10min。然后
6、，再將NC膜放入塑料袋中，加入酶標(biāo)二抗（一抗的抗體，含辣根過氧化物酶HRP）（二抗：封閉液=1:1000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育45min~1h。最后再次洗膜（同上）底物顯色取上述處理過的NC膜，于干燥潔凈的的玻璃板上，適當(dāng)晾干。按照體積比1:1取魯米諾和過氧化氫，混勻，滴加到NC膜上，保證NC膜完全浸潤其中。靜置3min，使反應(yīng)完全。然后適當(dāng)控干多余液體，將其平整的包裹于保鮮膜內(nèi)，趕走氣泡。將邊緣折疊整齊，放入暗盒內(nèi)，用標(biāo)簽紙貼牢。然后進(jìn)行曝光即可。此課件下載可自行編輯修改，僅供參考！ 感謝您的支持，我們努力做
7、得更好！謝謝
