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1、蛋白免疫印跡法WesternblotWesternBlot的原理SDS-PAGE原理Westernblot內(nèi)容v蛋白樣品的制備vSDS-PAGEv轉(zhuǎn)膜v封閉v一抗雜交v二抗雜交v底物顯色步驟v蛋白樣品的制備v1,在冰上收細(xì)胞,用PBS清洗兩次,洗去培養(yǎng)基。1500r,5min離心,棄去上清液。v2,裂解細(xì)胞(裂解液:PI:PMSF=100:1:1),根據(jù)所需蛋白濃度加細(xì)胞裂解液?;靹?。于冰上裂解20min。v3,14000r,10min離心。上清液即為所需蛋白樣品液。v4,用Bradford蛋白分析法測蛋白濃度。v5,按100ul裂解液加3
2、0ul的6X的loadingbuffer的比例,向蛋白樣品液中添加loadingbuffer。v6,于95℃,5min條件下對(duì)蛋白樣品進(jìn)行高溫變性。vSDS-PAGE:v1,灌膠:v(1)保證玻璃板干燥潔凈,玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊,垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。v(2)配好分離膠,加入TEMED,混勻后即可灌膠。灌膠過程中膠要沿著玻璃板流下,防止有氣泡產(chǎn)生。將膠灌至接近綠帶中線即可。v(3)用去離子水進(jìn)行液封,膠凝速度會(huì)更快(加水時(shí)速度要慢,防止膠被沖變形)v(4)待水與膠之間有一條折射線的時(shí),說明膠已經(jīng)凝固。此時(shí),可完全除去膠上層的水。v(5
3、)配制濃縮膠,加入TEMED,混勻后將剩余空間灌滿濃縮膠。然后插入梳子。待濃縮膠凝固后小心拔出梳子。v(6)用水沖洗一下膠板,裝入電泳槽中(小玻板面向內(nèi),大玻板向外;若只跑一塊板,槽的另一邊要放一塊塑料板,有字的一面向外)v2,電泳向電解槽中加入適量的RunningBuffer,將蛋白樣品以50ug的標(biāo)準(zhǔn)換算出的體積進(jìn)行上樣。以電壓120V或160V進(jìn)行電泳,電泳至前沿跑至最底端即可進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜用硝酸纖維素膜(NC膜),進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。組裝轉(zhuǎn)膜“三明治”的過程在Transferbuffer中進(jìn)行:黑的一面在下,依次放上濾紙、凝膠、NC膜、濾紙,
4、然后合上三明治。整個(gè)過程必須保證無氣泡。接著把轉(zhuǎn)膜“三明治”放入轉(zhuǎn)膜槽中,注意正負(fù)極放置正確。倒入適量的Transferbuffer。在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件:120V,1.5h或者150V,1h封閉轉(zhuǎn)膜結(jié)束后,取出NC膜,按照所需蛋白的位置,裁剪NC膜。使其浸潤于封閉液中,緩慢搖蕩1hv一抗雜交v封閉過后,把NC膜放入塑料袋中,按膜的大小加入適量的一抗溶液(一抗:封閉液=1:1000),密封,在搖床上緩慢搖蕩孵育4h。v二抗雜交v一抗孵育完成后,取出NC膜,交替加入TBST和TBS進(jìn)行洗膜,一共洗三次,每次7~10min。然后,再將NC
5、膜放入塑料袋中,加入酶標(biāo)二抗(一抗的抗體,含辣根過氧化物酶HRP)(二抗:封閉液=1:1000),密封,在搖床上緩慢搖蕩孵育45min~1h。最后再次洗膜(同上)v底物顯色v取上述處理過的NC膜,于干燥潔凈的的玻璃板上,適當(dāng)晾干。按照體積比1:1取魯米諾和過氧化氫,混勻,滴加到NC膜上,v保證NC膜完全浸潤其中。靜置3min,使反應(yīng)完全。然后適當(dāng)控干多余液體,將其平整的包裹于保鮮膜內(nèi),趕走氣泡。將邊緣折疊整齊,放入暗盒內(nèi),用標(biāo)簽紙貼牢。然后進(jìn)行曝光即可。