蛋白免疫印跡法Westernblot原理及步驟.ppt

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1、蛋白免疫印跡法WesternblotWesternBlot的原理SDS-PAGE原理Westernblot內(nèi)容v蛋白樣品的制備vSDS-PAGEv轉(zhuǎn)膜v封閉v一抗雜交v二抗雜交v底物顯色步驟v蛋白樣品的制備v1，在冰上收細(xì)胞，用PBS清洗兩次，洗去培養(yǎng)基。1500r,5min離心，棄去上清液。v2，裂解細(xì)胞（裂解液:PI:PMSF=100:1:1）,根據(jù)所需蛋白濃度加細(xì)胞裂解液?；靹?。于冰上裂解20min。v3，14000r,10min離心。上清液即為所需蛋白樣品液。v4，用Bradford蛋白分析法測蛋白濃度。v5，按100ul裂解液加3

2、0ul的6X的loadingbuffer的比例，向蛋白樣品液中添加loadingbuffer。v6，于95℃，5min條件下對(duì)蛋白樣品進(jìn)行高溫變性。vSDS-PAGE:v1，灌膠：v（1）保證玻璃板干燥潔凈，玻璃板對(duì)齊后放入夾中卡緊，垂直卡在架子上準(zhǔn)備灌膠。v（2）配好分離膠，加入TEMED，混勻后即可灌膠。灌膠過程中膠要沿著玻璃板流下，防止有氣泡產(chǎn)生。將膠灌至接近綠帶中線即可。v（3）用去離子水進(jìn)行液封，膠凝速度會(huì)更快（加水時(shí)速度要慢，防止膠被沖變形）v（4）待水與膠之間有一條折射線的時(shí)，說明膠已經(jīng)凝固。此時(shí)，可完全除去膠上層的水。v（5

3、）配制濃縮膠，加入TEMED,混勻后將剩余空間灌滿濃縮膠。然后插入梳子。待濃縮膠凝固后小心拔出梳子。v（6）用水沖洗一下膠板，裝入電泳槽中（小玻板面向內(nèi)，大玻板向外；若只跑一塊板，槽的另一邊要放一塊塑料板，有字的一面向外）v2，電泳向電解槽中加入適量的RunningBuffer,將蛋白樣品以50ug的標(biāo)準(zhǔn)換算出的體積進(jìn)行上樣。以電壓120V或160V進(jìn)行電泳，電泳至前沿跑至最底端即可進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜用硝酸纖維素膜（NC膜），進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。組裝轉(zhuǎn)膜“三明治”的過程在Transferbuffer中進(jìn)行：黑的一面在下，依次放上濾紙、凝膠、NC膜、濾紙，

4、然后合上三明治。整個(gè)過程必須保證無氣泡。接著把轉(zhuǎn)膜“三明治”放入轉(zhuǎn)膜槽中，注意正負(fù)極放置正確。倒入適量的Transferbuffer。在冰浴中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。轉(zhuǎn)膜條件：120V,1.5h或者150V，1h封閉轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，取出NC膜，按照所需蛋白的位置，裁剪NC膜。使其浸潤于封閉液中，緩慢搖蕩1hv一抗雜交v封閉過后，把NC膜放入塑料袋中，按膜的大小加入適量的一抗溶液（一抗：封閉液=1:1000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育4h。v二抗雜交v一抗孵育完成后，取出NC膜，交替加入TBST和TBS進(jìn)行洗膜，一共洗三次，每次7~10min。然后，再將NC

5、膜放入塑料袋中，加入酶標(biāo)二抗（一抗的抗體，含辣根過氧化物酶HRP）（二抗：封閉液=1:1000），密封，在搖床上緩慢搖蕩孵育45min~1h。最后再次洗膜（同上）v底物顯色v取上述處理過的NC膜，于干燥潔凈的的玻璃板上，適當(dāng)晾干。按照體積比1:1取魯米諾和過氧化氫，混勻，滴加到NC膜上，v保證NC膜完全浸潤其中。靜置3min，使反應(yīng)完全。然后適當(dāng)控干多余液體，將其平整的包裹于保鮮膜內(nèi)，趕走氣泡。將邊緣折疊整齊，放入暗盒內(nèi)，用標(biāo)簽紙貼牢。然后進(jìn)行曝光即可。