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《蛋白印跡——western-blot-實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫(kù)。
1、蛋白印跡——Westernblot實(shí)驗(yàn)流程及注意事項(xiàng)各種凝膠電泳方法可以直接了解蛋白的某些性質(zhì)如遷移率、電荷、大小、豐度以至蛋白的親疏水性等。此外，特異染色方法可用于識(shí)別不同種類的蛋白質(zhì)。Westernblot技術(shù)大大擴(kuò)展了凝膠電泳后識(shí)別和鑒定蛋白的可能性。這一技術(shù)首先將電泳分離后的蛋白質(zhì)條帶或斑點(diǎn)從凝膠介質(zhì)轉(zhuǎn)移到固相支持膜上，然后用特異性配體進(jìn)行檢測(cè)。特異性抗體和凝集素等已被廣泛應(yīng)用檢測(cè)印跡膜上的蛋白。印跡技術(shù)還常常作為電泳分離后用化學(xué)方法（如蛋白氨基端序列分析等）鑒定蛋白的一個(gè)重要步驟。一、聚丙烯酰胺凝膠電泳（Polyacrylamidege
2、lelectrophoresis,PAGE或SDS-PAGE）聚丙烯酰胺凝膠電泳簡(jiǎn)稱為PAGE（Polyacrylamidegelelectrophoresis），是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質(zhì)的一種常用電泳技術(shù)。聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺和甲叉雙丙烯酰胺聚合而成，聚合過(guò)程由自由基催化完成。催化聚合的常用方法有兩種：化學(xué)聚合法和光聚合法。化學(xué)聚合以過(guò)硫酸銨（AP）為催化劑，以四甲基乙二胺（TEMED）為加速劑。在聚合過(guò)程中，TEMED催化過(guò)硫酸銨產(chǎn)生自由基，后者引發(fā)丙烯酰胺單體聚合，同時(shí)甲叉雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產(chǎn)生甲叉鍵交聯(lián)，從而形成三維網(wǎng)
3、狀結(jié)構(gòu)。PAGE根據(jù)其有無(wú)濃縮效應(yīng)，分為連續(xù)系統(tǒng)和不連續(xù)系統(tǒng)兩大類，連續(xù)系統(tǒng)電泳體系中緩沖液pH值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場(chǎng)作用下，主要靠電荷和分子篩效應(yīng)。不連續(xù)系統(tǒng)中由于緩沖液離子成分，pH，凝膠濃度及電位梯度的不連續(xù)性，帶電顆粒在電場(chǎng)中泳動(dòng)不僅有電荷效應(yīng)，分子篩效應(yīng)，還具有濃縮效應(yīng)，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。不連續(xù)體系由電極緩沖液、濃縮膠及分離膠所組成。濃縮膠是由AP催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7的Tris-HCL。分離膠是由AP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9Tris-HCL。電極緩沖液是pH8.
4、3Tris-甘氨酸緩沖液。2種孔徑的凝膠、2種緩沖體系、3種pH值使不連續(xù)體系形成了凝膠孔徑、pH值、緩沖液離子成分的不連續(xù)性，這是樣品濃縮的主要因素。實(shí)驗(yàn)步驟1.配制分離膠5ml（配方見(jiàn)圖1）；2.將液體用1ml移液器加入玻璃板（從玻璃板的邊緣加入，速度適中，盡量不要產(chǎn)生氣泡）；3.用去離子水壓膠（利用重力作用把膠壓平，否則如果有氣泡，膠就不平了，影響電泳效果。注意上面蓋一保鮮膜，防止液體揮發(fā)）；4.大約1小時(shí)后（也可以第一天晚上配好分離膠過(guò)夜，第二天一早配制堆積膠），配制堆積膠1ml。5.倒掉玻璃板上面的水并用濾紙吸干，加入堆積膠，并插入梳子
5、；6.約1小時(shí)后堆積膠凝固，把玻璃板轉(zhuǎn)移到電泳裝置并加緊（防止漏液）；7.將電泳裝置內(nèi)加入電泳緩沖液并觀察是否漏液；8.拔掉梳子，用微量注射器沖洗上樣孔，加入和上樣緩沖buffer混合變性的蛋白；①蛋白上樣量：20-50μg；②上樣緩沖液：加入5×SDS上樣緩沖液至終濃度為1×；③上樣最大體積：根據(jù)梳子孔徑和玻璃板的距離而定，一般我們用的上樣最大體積在30ul左右；④蛋白變性：上樣前要將樣品于沸水中煮5-10min使蛋白變性?？梢允褂肞CR儀進(jìn)行變性，99℃5分鐘，加快速度，這樣就不用將水煮沸了，同時(shí)在水中煮蛋白樣品有下面弊端：a.EP管容易炸開(kāi)
6、，樣品丟失；b.容易進(jìn)水，使樣品體積增加，超過(guò)電泳最大上樣量；9.在電泳槽中加入電泳緩沖液；10.恒壓80V30分鐘，100V2小時(shí)左右，溴酚藍(lán)跑到底即可（電泳時(shí)間可以根據(jù)自己目的蛋白的具體條件設(shè)置，一般4～5h，電壓為40V較好，也可用60V。）；圖1配膠說(shuō)明液體配制1.0mol/LTris·HClTris(MW121.14)30.29g蒸餾水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至所需點(diǎn)（見(jiàn)下所示），最后用蒸餾水定容至250ml，高溫滅菌后室溫下保存。PHHCl（ml）7.4177.5167.6158.0101.5mol/LTris·HCl（pH8
7、.8）Tris(MW121.14)45.43g超純水200ml溶解后，用濃鹽酸調(diào)pH至8.8，最后用超純水定容至250ml，室溫下保存。10％SDSSDS10g蒸餾水至100ml50℃水浴下溶解，室溫保存。如在長(zhǎng)期保存中出現(xiàn)沉淀，水浴溶化后，仍可使用。10％過(guò)硫酸胺（AP）過(guò)硫酸胺0.1g超純水1.0ml溶解后，4℃保存，保存時(shí)間為1周。（可先將過(guò)硫酸胺干粉稱好分量后放在EP管中，一次性多裝幾管，使用時(shí)加入超純水即可）30％Acr/Bis（29:1）丙烯酰胺Acr29gN-N-雙丙烯酰胺Bis1g溶于總體積為60ml的ddH2O中加熱至37℃溶解
8、補(bǔ)水至總體積為100ml查證該溶液的pH＜7.0過(guò)濾后在棕色瓶中4℃保存。5×loadingbuffer0.5mol/LTris·HCl
