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1、實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案細(xì)胞總蛋白的提?。?）離心后，棄去上清液，將收集的細(xì)胞用手指輕彈重懸于剩余的少量上清液中，轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管內(nèi)，用1×PBS溶液洗滌2次，每次加入1mLPBS溶液，1000r/min，4℃離心5min，棄上層液體。洗滌兩次后，將上清液完全去除，用手指輕彈細(xì)胞團(tuán)，使其分散重懸（若不分散，則無(wú)法與裂解液充分混勻）。（2）每管加入細(xì)胞團(tuán)等體積的含蛋白酶抑制劑cocktail的RIPA細(xì)胞裂解液；如需檢測(cè)磷酸化蛋白，則需另加入磷酸酶抑制劑。使細(xì)胞裂解液與細(xì)胞充分混勻，冰上裂解30min。如暫不提取蛋白，也可在洗滌細(xì)胞2次后加入
2、含蛋白酶抑制劑cocktail和磷酸酶抑制劑的1×PBS約100μL，1000r/min，4℃離心5min后，完全棄上層液體，置于-80℃冰箱保存?zhèn)溆?。?）冰上超聲處理細(xì)胞，每次超聲2s，間隔3s，約10-20次。（4）13000r/min，4℃離心15min，收集上清溶液至另一干凈并預(yù)冷的1.5mL離心管中，于-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?.BCA法測(cè)定蛋白質(zhì)濃度（1）配制工作液根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品的個(gè)數(shù)，按BCA試劑A和試劑B體積比為50:1配制足量BCA工作液，充分混勻，置于常溫備用。（2）配制標(biāo)準(zhǔn)品取原標(biāo)準(zhǔn)品BSA（2mg/mL）
3、約100μL，取出50μL，用ddH2O按對(duì)數(shù)法稀釋成如下濃度：1mg/mL、0.5mg/mL、0.25mg/mL、0.125mg/mL、0.0625mg/mL；設(shè)置96孔板第一橫排第一孔為空白孔，第二橫排第一、二孔加入20μL1×PBS，從第三橫排起，按濃度梯度由低到高依次取20μL標(biāo)準(zhǔn)品至96孔板中，每一濃度做2個(gè)平行孔。（3）稀釋待測(cè)樣品取5μl待測(cè)蛋白樣品，用ddH2O稀釋到50μL，分別取20μL至96孔板中，每一濃度做2個(gè)平行孔；（4）分別加入200μLBCA工作液到蛋白標(biāo)準(zhǔn)品及待測(cè)樣品中，輕輕混勻，并去掉每孔中的氣泡，置
4、于溫箱37℃孵育30min。（5）將96孔板取出后用酶標(biāo)儀測(cè)定OD570nm值。（6）根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的OD570nm值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算得到待測(cè)樣品的蛋白質(zhì)濃度。蛋白質(zhì)變性（1）根據(jù)預(yù)計(jì)將要上樣的蛋白質(zhì)樣品質(zhì)量（25μg-50μgμg，是蛋白質(zhì)而定），取適量體積的蛋白質(zhì)樣品于預(yù)冷的EP管中，加入5×SDS上樣緩沖液（體積約為蛋白質(zhì)樣品體積的25%），通過(guò)調(diào)節(jié)上樣緩沖液的體積將各樣品混合液的終體積調(diào)節(jié)至相仿。用封口膜將離心管封口，7000r/min離心點(diǎn)離樣品混合液3s，使其混合均勻。（2）將放置樣品混合液的架子置于盛有適量d
5、dH2O的磁盤(pán)中，用電磁爐加溫至100℃，煮沸5min。點(diǎn)離樣品，使其混合均勻。2.34.54.SDS-PAGE分離蛋白質(zhì)根據(jù)將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)大小，首先確定配制10%的分離膠（10ml）：ddH2O4ml30%Acr-Bis3.3ml精彩文檔實(shí)用標(biāo)準(zhǔn)文案1.0MTris-HCl（pH8.8）2.5ml10%SDS0.1ml10%AP0.1mlTEMED0.005ml將配置好的液體吹打混勻，灌膠，再用注射器將ddH2O緩慢均勻的加于分離膠上層，待膠凝固后（光下可見(jiàn)明顯的水膠分離線）將上層水倒掉，并用濾紙盡量將水吸干（注意不要碰到分離膠）
6、。然后配制4%濃縮膠（3ml）：ddH2O1.8ml30%Acr-Bis0.4ml1.0MTris-HCl（pH6.8）0.76ml10%SDS0.03ml10%AP0.03mlTEMED0.003ml將配置好的液體吹打混勻后，迅速灌膠并馬上插入梳齒，待膠充分凝固后放入垂直電泳槽內(nèi)，加入電泳緩沖液，小心將梳齒拔出，每孔加入等質(zhì)量變性蛋白質(zhì)（根據(jù)不同的蛋白質(zhì)具體的上樣質(zhì)量會(huì)有所變化，但相同蛋白質(zhì)的上樣質(zhì)量始終不變）后進(jìn)行電泳。先采用80V恒壓電泳約30min后，改用100V恒壓電泳約2h（具體視溴酚藍(lán)跑到膠的最底端的時(shí)間而定）。2.34
7、.6轉(zhuǎn)膜（1）預(yù)先裁剪出大小適宜的PVDF膜和濾紙，盡量使PVDF膜面積稍大于凝膠，但不大于海綿。（2）電泳結(jié)束后，將凝膠剝下，小心的將濃縮膠切除，將分離膠浸泡于預(yù)冷的轉(zhuǎn)移緩沖液中約15min，洗去雜質(zhì)。（3）將PVDF膜完全浸泡在甲醇中約30s。（4）在倒?jié)M轉(zhuǎn)移緩沖液的塑料盤(pán)中依次加入轉(zhuǎn)膜用的夾子（正極一側(cè)在下，保持水平）、一塊海綿墊、濾紙、浸泡好的PVDF膜、浸泡好的凝膠、濾紙和另一塊海綿墊，整個(gè)操作過(guò)程中要不斷趕走氣泡，在夾緊夾子前要確認(rèn)各層中沒(méi)有氣泡（否則會(huì)影響轉(zhuǎn)膜結(jié)果）。（5）將夾子放入電泳轉(zhuǎn)移槽中，確認(rèn)夾子的正負(fù)極與轉(zhuǎn)移槽
8、正負(fù)極相對(duì)，整個(gè)轉(zhuǎn)移槽埋在冰中進(jìn)行轉(zhuǎn)膜。根據(jù)將要檢測(cè)的蛋白質(zhì)分子量大小確定轉(zhuǎn)膜時(shí)間，小分子蛋白一般為恒壓80V，1.5h；大分子蛋白一般為恒壓100v，2h。（6）轉(zhuǎn)膜結(jié)束后打開(kāi)夾子，小心去除負(fù)極一端的海綿、濾紙和膠，在
