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1、WesternBlotting虞峰09.6.5一、試劑配制1.基礎(chǔ)試劑10%SDS10gSDS加雙蒸水溶解，定容至100mL，室溫保存1.0mol/LTris-HCl（pH6.8）12.12gTris，用濃HCl調(diào)pH至6.8，加雙蒸水至100mL，滅菌后4℃保存1.0mol/LTris-HCl（pH7.5）12.12gTris，加雙蒸水至80-90mL,用濃HCl調(diào)pH至7.5，加雙蒸水至100mL，滅菌后4℃保存1.5mol/LTris-HCl(pH8.8)18.16gTris,加雙蒸水至80-90mL，用濃HCl調(diào)pH至8.8，加雙
2、蒸水水至100mL，滅菌后4℃保存0.25mol/LEDTA(pH8.0)9.31gEDTA，加80-90mL雙蒸水溶解，,用固體NaOH調(diào)pH至8.0，定容至100mL30%Acr-Bismixture29gAccylamide,1gBis-acrtamide,加雙蒸水溶解，定容至100mL，4℃避光冷藏10%AP0.6g過硫酸銨，加雙蒸水溶解，定容至6mL，分裝160μL/管，-20℃冷凍保存2.BuffersLysisbuffer1mol/LTrisHCl(pH7.5)5mL(50mmol/L)0.1mol/LEDTA5mL(5mm
3、ol/L)TritonX-1001mL(1%V/V)NaCl0.8775gAddDDwaterUpto100mL6XLoadingBuffer配法：不含DTT的LoadingBufferTirsHCl(pH8.0)25mL甘油100mL10%SDS80mL溴酚藍0.080g取10mL不含DTT的LoadingBuffer,加入0.540gDTT，溶解后分裝，保存在-20℃10XRunningBufferTris36.2g甘氨酸144gSDS10g加雙蒸水至1L5/510XTBSTris24.2gNaCl80g加雙蒸水至1LTBST10xT
4、BS100mLTween-201mL加雙蒸水至900mL，調(diào)pH=7.4,加雙蒸水定容至1L1XTransBuffer（半干轉(zhuǎn)膜用）Tris-base5.82g甘氨酸Glycine2.93gSDS0.375g甲醇200mL加雙蒸水至1L也可配制時不加甲醇,臨用時再添加.如果配制的是含有甲醇的溶液，必須用密封容器盛裝，以免甲醇揮發(fā)10XTransBuffer（濕法轉(zhuǎn)膜用）甘氨酸144gTris33.3g加雙蒸水定容至1L1XTransBuffer（濕法轉(zhuǎn)膜用）用雙蒸水把10X的TransBuffer（濕法轉(zhuǎn)膜用）稀釋到1X的濃度。置于0度或
5、4度冰箱備用。5/53.Gels分離膠10mL6%8%8%10%12%H2O5.33.454.64.03.330%Acr-Bis2.01.952.73.34.01.5mol/LTris-HCl(pH8.8)2.51.952.52.52.510%SDS0.10.0750.10.10.110%過硫酸銨0.10.0750.10.10.1TEMED0.0080.00450.0060.0060.006濃縮膠3mL5%H2O2.130%AcrBismix0.51.0mol/LTris-HCl（pH6.8）0.3810%SDS0.0310%過硫酸銨0.
6、03TEMED0.003*****以上單位都是mL*****可分離的目標蛋白分子量(kD)范圍凝膠濃度4-2020%12-4515%10-7012.5%15-10010%25-2008%常用內(nèi)參分子量(kD)β-actin43GAPDH30-40(43)Tubulin55實驗室的電泳槽濃縮膠電壓/V分離膠電壓/VHoeffer69.6130.5BioRed58.4109.5蛋白提取A.貼壁細胞1.用3mLPBS洗一下細胞2.倒干PBS（盡量干），加入100μLLysisBuffer（每106細胞約60μL）。六孔板則每孔75μL3.冰上放
7、置30-45分鐘4.4℃12000g，5min，取上清，注意不要吸到沉淀5.應(yīng)當(dāng)在2小時內(nèi)用蛋白定量分析試劑盒測定蛋白含量，6.按測出的濃度，取100-500μg,用Lysisbuffer稀釋，按比例加入Loading5/5Buffer后沸水浴3min7.保存在-20℃B.組織1.剪取適量組織，稱重，按每1g組織加入4mLLysisBuffer和50μLCocktail蛋白酶抑制劑2.加液氮，在研缽中研碎，或是用移液槍打碎3.冰上放置30-45min4.4℃12000g，2min，取上清，注意不要吸到沉淀5.保存在-70℃（-20℃短期保
8、存）6.用蛋白定量分析試劑盒測定蛋白含量，7.按測出的濃度，取100-200μg,用Lysisbuffer稀釋，按比例加入LoadingBuffer后沸水浴5min8.保存在-20℃制膠1.選
