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1、蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）方法原理和優(yōu)化已有2975次閱讀2008-6-1910:43
2、個(gè)人分類:生活點(diǎn)滴蛋白質(zhì)印跡（Westernblotting）方法原理和優(yōu)化抽濾 抽濾是一種直接將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到膜上的方法。利用真空使溶解的樣品濾過膜，蛋白質(zhì)吸附到膜上，同時(shí)樣品中其它成分被真空抽走。另外，也可直接將樣品點(diǎn)在膜表面使之干燥。隨后可對固定在膜上的蛋白質(zhì)進(jìn)行分析。 點(diǎn)印記和狹縫印記是抽濾方法的兩種變型，用多支管裝置將樣品加到膜上成點(diǎn)狀或狹縫圖樣。這些方法可用于快速定性篩選大量樣品或定量分析類似樣品，
3、尤其是測試復(fù)雜分析中實(shí)驗(yàn)參數(shù)的適用性?！ ×硪环N抽濾方法的變型是格柵免疫印跡，這種方法適用于高度平行的樣品分析，當(dāng)樣品量及其優(yōu)先并且不能用常規(guī)方法如ELISA進(jìn)行分析時(shí)使用。格柵免疫印跡可用于表征變態(tài)反應(yīng)原-特異性抗體應(yīng)答，只需最小量的病人血清。當(dāng)準(zhǔn)備抽濾印跡膜時(shí)，要考慮以下方面： 去污劑可以抑制蛋白吸附到膜上。用于樣品溶解和漂洗的緩沖液所含去污劑不應(yīng)超過0.05%，并且僅當(dāng)必要時(shí)才能加入。 樣品體積應(yīng)足以覆蓋每個(gè)孔中的膜面積，但所含蛋白量不應(yīng)超過膜的結(jié)合能力?！ 『^多顆粒的樣品可能堵塞膜孔，而高黏度樣品將降低
4、流速。所以在結(jié)合前先通過預(yù)過濾或離心除去顆粒，只將上清加到膜上。而粘性樣品要用緩沖液稀釋。Western印跡Western印跡含一系列步驟，包括：??用聚丙烯酰胺凝膠分離蛋白樣品。??將膠上的蛋白轉(zhuǎn)移到膜上。??鑒定膜上特定蛋白。下面將從理論和實(shí)踐方面討論Western印跡方法。用1-D或2-D凝膠分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物 印跡前分離復(fù)雜蛋白質(zhì)混合物的最常見方法是一維（1-D）SDS-PAGE電泳，它根據(jù)蛋白質(zhì)的分子量進(jìn)行分離。有時(shí)用非變性電泳分離天然蛋白質(zhì)。盡管這種方法通常缺乏變性電泳的分辨率，但當(dāng)?shù)鞍醉毐Ａ羯锘钚?/p>
5、時(shí)非常有用。 二維（2-D）凝膠電泳用于分析細(xì)胞、組織、和體液蛋白質(zhì)的組成，是現(xiàn)代蛋白質(zhì)組學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)。2-D免疫印跡可提供分子量和等電點(diǎn)信息，并可用于區(qū)分翻譯后修飾產(chǎn)生的不同蛋白質(zhì)形式。有些情況下只進(jìn)行1-D電泳分離也可用免疫印跡對蛋白分型。分子量標(biāo)準(zhǔn) 在凝膠中加入分子量標(biāo)準(zhǔn)或標(biāo)記物可以在電泳分離后估計(jì)感興趣蛋白質(zhì)的大小。有兩種類型的分子量標(biāo)準(zhǔn)：未染色和預(yù)染色。未染色分子量標(biāo)準(zhǔn)通常由天然或重組的純化蛋白混合物組成。在凝膠或膜上顯示其位置需要染色步驟。預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)允許在電泳過程中監(jiān)測蛋白分離，也可以在隨后的印跡步驟中
6、指示轉(zhuǎn)移效率。然而，它們比較昂貴且加入染料會(huì)影響蛋白遷移率。預(yù)染標(biāo)準(zhǔn)在確定分子量時(shí)可能不夠精確，并且蛋白質(zhì)上附加的染料在轉(zhuǎn)移時(shí)會(huì)影響它們吸附到膜上的能力。聚丙烯酰胺濃度 凝膠中聚丙烯酰胺濃度可以是均一濃度或是梯度濃度。最常見的聚丙烯酰胺濃度為10%，最適合分離10-150KD范圍內(nèi)的蛋白質(zhì)。若要分析未知蛋白或許要更寬的分離范圍，推薦使用梯度膠。例如：4-12%Tris-glycine凝膠適合于30-200KD蛋白質(zhì)的分離，而10-20%凝膠則能成功地分離6-15KD的蛋白質(zhì)。SDS-PAGE凝膠通常為1.0到1.5
7、mm厚；但蛋白轉(zhuǎn)印最好使用更薄的膠。凝膠電泳緩沖液 最常見的凝膠電泳緩沖液由Tris-甘氨酸或Tris-tricine組成。緩沖液可以包含0.1%去污劑，通常是SDS。Tris-甘氨酸凝膠可用于分離很寬分子量范圍（6-200KD）的蛋白質(zhì)，并可與變性或非變性條件相容。Tris-tricine最適于分離小分子蛋白質(zhì)（<10KD）,加樣之前還需要還原變性。兩種緩沖系統(tǒng)都與蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印PVDF膜兼容。Tris-乙酸緩沖液有時(shí)被用來分離大分子蛋白。將蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜 蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上的過程中同時(shí)保持它們的相對位置
8、和分辨率，這被稱為印跡。印跡可以以三種不同的方式實(shí)現(xiàn)： 簡單擴(kuò)散：將膜放在凝膠上，同時(shí)放一沓干濾紙?jiān)谀ど希⒃跒V紙上放置重物以加快擴(kuò)散過程。這種方法可用于將蛋白質(zhì)從一塊凝膠上轉(zhuǎn)移到多個(gè)膜上，同一凝膠可得到幾個(gè)印跡膜。擴(kuò)散法的主要缺點(diǎn)是不能定量轉(zhuǎn)移，與電轉(zhuǎn)比較只能轉(zhuǎn)移25-50%的蛋白質(zhì)?！ ≌婵蛰o助溶劑流動(dòng)：用泵的吸力將分離的蛋白質(zhì)從凝膠轉(zhuǎn)移到膜上，高低分子量的蛋白質(zhì)都可以用這種方法轉(zhuǎn)移；然而，分子量小于14KD的蛋白質(zhì)需要用較小孔徑的膜（0.2um），因?yàn)樗鼈儾灰妆?.45um膜吸附。很少從聚丙烯酰胺凝膠中真空轉(zhuǎn)
9、印蛋白質(zhì)，而從瓊脂糖中轉(zhuǎn)移核酸則常用此法。 電洗脫或電轉(zhuǎn)移：最常用的轉(zhuǎn)移方法，與擴(kuò)散或真空印跡相比，其主要優(yōu)點(diǎn)是速度和轉(zhuǎn)移更完全。電轉(zhuǎn)移方法 兩種常用的電轉(zhuǎn)移方法是濕轉(zhuǎn)和半干轉(zhuǎn)。兩者的原理完全相同，只是用于固定膠/膜疊層和施加電場的機(jī)械裝置不同?！ 褶D(zhuǎn)是一種傳統(tǒng)方法，將膠/膜疊層浸入緩沖液槽然后加電壓。這是一種有效方法但比較慢，需要大體積
