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《CE分離條件的優(yōu)化方法ppt課件.ppt》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫。
1、毛細(xì)管電泳分離條件 選擇策略概述毛細(xì)管電泳分離條件選擇的內(nèi)容很多，且與樣品、分離模式、檢測方式、進(jìn)樣方法乃至儀器系統(tǒng)結(jié)構(gòu)等相關(guān)，但有許多共同之處，這里將對普遍性的問題進(jìn)行考察，包括毛細(xì)管電泳模式選定、儀器操作條件確定、介質(zhì)選擇等。毛細(xì)管電泳模式的選定毛細(xì)管電泳有許多不同的模式，因而在分離樣品前必需很好選擇分離模式，以達(dá)到最佳的分離結(jié)果。毛細(xì)管電泳模式的選擇，可以有不同的原則，比如簡單性、目的性、普適性、選擇性、樣品特異性等。毛細(xì)管電泳模式的選定以簡單性為原則時，所選分離模式的操作、條件優(yōu)化、分離控
2、制等必需是最簡單和最容易的，而且富于后續(xù)變化。根據(jù)這一道理，首先應(yīng)該考慮自由溶液分離模式，最后才考慮填充形式的分離模式。簡單性原則是毛細(xì)管電泳模式選擇的一般規(guī)則。毛細(xì)管電泳模式的選定在分離生物樣品時，通常需要根據(jù)分離的目的來選擇分離模式：欲測定樣品的尺寸，就須選NGCE或CGE，偶可選用CZE或MEKC；要測定樣品的等電點，則應(yīng)選用CIEF；在進(jìn)行親和作用研究時，則應(yīng)當(dāng)首先選用ACE。毛細(xì)管電泳模式的選定我們的分析目的可能并不是單一的，這時的分離模式選擇，就應(yīng)該注意考慮其通用性。CZE、MEKC和
3、CEC的通用性和可調(diào)節(jié)性都較大，但根據(jù)簡單性原則，還以CZE或MEKC為優(yōu)。注意，填充型毛細(xì)管電泳不適合于顆粒樣品的分離，甚至也不適合于大分子分離。毛細(xì)管電泳模式的選定有時，我們會特別注重分離的選擇性，即只希望把目標(biāo)組分分離出來。此時應(yīng)優(yōu)先考慮選擇性高的分離模式，如ACE等。如果已知樣品的某些特性，也可以據(jù)此選擇分離模式，比如在分離蛋白質(zhì)和多肽等兩性樣品時，可以優(yōu)先考慮CIEF；在分離中性分子時，優(yōu)先考慮MEKC；在分離水難溶組分時，優(yōu)先考慮非水毛細(xì)管電泳形式等。毛細(xì)管電泳模式的選定實際樣品五花八
4、門，性質(zhì)各異，分離模式的選擇是可變的和靈活的。這種靈活性恰好與毛細(xì)管電泳模式間的易換性相吻合?；静僮鳁l件選擇這里所謂的操作條件包括：電泳電壓、溫度、毛細(xì)管尺寸、進(jìn)樣方法、檢測條件等，下面分別討論之。電泳電壓理論和實驗均表明，效率與電壓間存在極大值。極大電壓通常也是最佳工作電壓。在實際分離中，如果所用的毛細(xì)管很細(xì)或緩沖液的電導(dǎo)很低，則極大電壓可能會超出儀器的控制范圍，此時沒有最佳電壓，可選用儀器允許的最大輸出電壓。當(dāng)毛細(xì)管較粗或緩沖液電導(dǎo)較高時，極大電壓有可能很小，若此時的分離度很高，也可以選擇大
5、于極大值的電壓進(jìn)行分離。電泳電壓極大電壓可以利用理論計算或?qū)嶒灉y定來獲得。利用理論效率方程，通過求極值的方法可以確定極大電壓。理論計算過程往往繁瑣，而且也不很可靠，通過實驗測定來確定工作電壓其實非常簡單。根據(jù)歐姆定律，電流和電壓具有線性關(guān)系，如能測定電壓與電流的關(guān)系曲線就不難確定工作電壓。電泳電壓方法如下：①在電泳條件下，改變電壓（或電流）測定對應(yīng)的電流（或電壓）；②做電壓～電流曲線；③取線性關(guān)系中的最大電壓（或電流），作為分離電壓（或電流）。線性以上的電壓，焦耳熱效應(yīng)過大，一般不宜選用。但如果分
6、離效率很高，就可以選用，以便加快分離速度。在做CGE時，電場強度應(yīng)控制在150～400V/cm之間，否則容易導(dǎo)致凝膠的破壞。電泳電壓除工作電壓選擇外，還應(yīng)考慮電壓施加方式的選擇。理論上，毛細(xì)電泳可有恒流、恒壓、恒功率、梯度升（降）壓分離等不同的工作方式。目前，絕大多數(shù)分離采用瞬間升壓的恒壓工作方式。實際上，采用恒流工作方式有利于提高分離的重現(xiàn)性，在沒有良好恒溫控制的系統(tǒng)上進(jìn)行電泳時，建議采用恒流或恒功率操作。經(jīng)驗表明，采用升壓（升流）分離，可以有效提高分離度，有條件時，應(yīng)當(dāng)充分考慮線性升壓的工作方
7、式。在微量制備研究中，還需要考慮降壓分離過程，以便于餾分的準(zhǔn)確收集。電泳溫度電泳溫度的選擇，主要是指毛細(xì)管外表溫度的選擇與控制。溫度變化不僅影響分離的重現(xiàn)性，而且影響分離效率。溫度選擇應(yīng)考慮：熱效應(yīng)控制、重現(xiàn)性控制、分離效率控制和分離介質(zhì)對溫度的限制等因素。熱效應(yīng)控制旨在避免管內(nèi)溶液因過熱而出氣泡或沸騰，顯然溫度越低越好；重現(xiàn)性控制意在避免溫度波動；分離效率控制的目的在于提高分離度，依據(jù)樣品性質(zhì)的變化而高低不等，需由實驗來測定。此外，某些介質(zhì)對工作溫度有一定的限制，比如凝膠介質(zhì)不能適應(yīng)忽高忽低的溫
8、度變化，也不宜在過高或過低的溫度中電泳。電泳溫度多數(shù)情況下，在20～30℃之間進(jìn)行電泳，就能獲得良好的分離結(jié)果。如若不然，便需調(diào)整或優(yōu)化溫度。優(yōu)化多從室溫開始，向上搜尋，若無結(jié)果，再向下搜尋。不少糖類樣品需要高于室溫的分離環(huán)境，有些樣品如蛋白等則可能需要低于室溫的分離條件。電泳溫度毛細(xì)管電泳溫度的選擇，目前還受到儀器條件的限制，大多數(shù)商品儀器只能在20～50℃之間進(jìn)行選擇，而且不能實現(xiàn)溫度梯度控制。此方面的研究還有待進(jìn)一步展開。電聚焦當(dāng)離子從高電場突然進(jìn)入低電場時，會因減速而堆集在
