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《膠體金標(biāo)記流程.doc》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在教育資源-天天文庫(kù)。
1、膠體金標(biāo)記流程（一）?原理?免疫膠體金技術(shù)是以膠體金作為示蹤標(biāo)志物應(yīng)用于抗原抗體的一種新型的免疫標(biāo)記技術(shù)。膠體金是由氯金酸（HAuCl4）在還原劑如檸檬酸三鈉、白磷、抗壞血酸、枸櫞酸鈉、鞣酸等作用下，聚合成為特定大小的金顆粒，并由于靜電作用成為一種穩(wěn)定的膠體狀態(tài)，稱為膠體金。膠體金在弱堿環(huán)境下帶負(fù)電荷，可與蛋白質(zhì)分子的正電荷基團(tuán)形成牢固的結(jié)合，由于這種結(jié)合是靜電結(jié)合，所以不影響蛋白質(zhì)的生物特性。膠體金除了與蛋白質(zhì)結(jié)合以外，還可以與許多其它生物大分子結(jié)合，如SPA、PHA、ConA等。根據(jù)膠體金的一些物理性狀，如高電子密
2、度、顆粒大小、形狀及顏色反應(yīng)，加上結(jié)合物的免疫和生物學(xué)特性，因而使膠體金廣泛地應(yīng)用于免疫學(xué)、組織學(xué)、病理學(xué)和細(xì)胞生物學(xué)等領(lǐng)域。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogoldlabellingtechique)主要利用了金顆粒具有高電子密度的特性，在金標(biāo)蛋白結(jié)合處，在顯微鏡下可見(jiàn)黑褐色顆粒，當(dāng)這些標(biāo)記物在相應(yīng)的配體處大量聚集時(shí)，肉眼可見(jiàn)紅色或粉紅色斑點(diǎn)，因而用于定性或半定量的快速免疫檢測(cè)方法中，這一反應(yīng)也可以通過(guò)銀顆粒的沉積被放大，稱之為免疫金銀染色。（二）?器皿及試劑的處理1.玻璃器皿的清潔制備膠體金的成功與失敗除試劑因素以外玻
3、璃器皿清潔是非常關(guān)鍵的一步。如果玻璃器皿內(nèi)不干凈或者有灰塵落入就會(huì)干擾膠體金顆粒的生成，形成的顆粒大小不一，顏色微紅、無(wú)色或混濁不透明。我們的經(jīng)驗(yàn)是制備膠體金的所有玻璃器皿先用自來(lái)水把玻璃器皿上的灰塵流水沖洗干凈，加入清潔液（重鉻酸鉀1000g,加入濃硫酸2500ml，加蒸餾水至10000ml）浸泡24h，自來(lái)水洗凈清潔液，然后每個(gè)玻璃器皿用洗潔劑洗3～4次，自來(lái)水沖洗掉洗潔劑，用蒸餾水洗3～4次，再用雙蒸水把每個(gè)器皿洗3～4次，烤箱干燥后備用。通過(guò)此方法的處理玻璃器皿不需要硅化處理，而直接制備膠體金。也可用已經(jīng)制備的
4、膠體金溶液，用同等大小顆粒的金溶液去包被所用的玻璃器皿的表面，然后棄去，再用雙蒸水洗凈，即可使用，這樣效果更好，因?yàn)闇p少了金顆粒的吸附作用。2.試劑的配制要求（1）所有配制試劑的容器均按以上要求酸處理洗凈，配制試劑用雙蒸餾水或三蒸餾水。（2）氯化金（HAuCl4）水溶液的配制：將lg的氯化金一次溶解于雙蒸水中配成1%的水溶液。放在4℃冰箱內(nèi)保存長(zhǎng)達(dá)幾個(gè)月至1年左右，仍保持穩(wěn)定。（三）?膠體金的制備1．制備方法膠體金的制備多采用還原法。氯金酸（HAuCl4）是主要還原材料，常用還原劑有檸檬酸三鈉、鞣酸、抗壞血酸、白磷、硼
5、氫化鈉等。根據(jù)還原劑類型以及還原作用的強(qiáng)弱，可以制備0.8nm～150nm不等的膠體金。最常用的制備方法為檸檬酸鹽還原法。具體操作方法如下：（1）將HAuC14先配制成0.01％水溶液，取100ml加熱至沸。（2）攪動(dòng)下準(zhǔn)確加入一定量的1％檸檬酸三鈉（Na3C6H5O7?2H2O）水溶液。（3）繼續(xù)加熱煮沸15min。此時(shí)可觀察到淡黃色的氯金酸水溶液在檸檬酸鈉加入后很快變灰色，續(xù)而轉(zhuǎn)成黑色，隨后逐漸穩(wěn)定成紅色。全過(guò)程約2～3min。（4）冷卻至室溫后用蒸餾水恢復(fù)至原體積。用此法可制備16～147nm粒徑的膠體金。金顆粒
6、的大小取決于制備時(shí)加入的檸檬酸三鈉的量。表1列舉制備4種不同粒徑膠體金時(shí)檸檬酸三鈉的用量。表1四種粒徑膠體金的制備及特性金粒直徑（nm）1％檸檬酸三鈉加入量（ml）膠體金特性呈色λmax162.00橙色518nm24.51.50橙色522nm411.00紅色525nm71.50.70紫色535nm注意事項(xiàng)：（1）易潮解，應(yīng)干燥、避光保存。（2）氯金酸對(duì)金屬有強(qiáng)烈的腐蝕性，因此在配制氯金酸水溶液時(shí)，不應(yīng)使用金屬藥匙稱量氯金酸。（3）用于制備膠體金的蒸餾水應(yīng)是雙蒸餾水或三蒸餾水，或者是高質(zhì)量的去離子水（18M）。（4）用以
7、制備膠體金的玻璃容器必須是絕對(duì)清潔的，用前應(yīng)先經(jīng)酸洗并用蒸餾水沖凈。最好是經(jīng)硅化處理的，硅化方法可用5％二氯甲硅烷的氯仿溶液浸泡數(shù)分鐘，用蒸餾水沖凈后干燥備用。（5）膠體金的鑒定和保存：膠體金的制備并不難，但要制好高質(zhì)量的膠體金卻也并非易事。因此對(duì)每次制好的膠體金應(yīng)加以檢定，主要檢查指標(biāo)有顆粒大小，粒徑的均一程度及有無(wú)凝集顆粒等。肉眼觀察是最基本也是最簡(jiǎn)單和方便的檢定方法，但需要一定的經(jīng)驗(yàn)。良好的膠體金應(yīng)該是清亮透明的，若制備的膠體金混濁或液體表面有漂浮物，提示此次制備的膠體金有較多的凝集顆粒。在日光下仔細(xì)觀察比較膠體
8、金的顏色，可以粗略估計(jì)制得的金顆粒的大小。當(dāng)然也可用分光光度計(jì)掃描λmax來(lái)估計(jì)金顆粒的粒徑。制備的膠體金最好作電鏡觀察，并選一些代表性的作顯微攝影，可以比較精確地測(cè)定膠體金的平均粒徑。膠體金在潔凈的玻璃器皿中可較長(zhǎng)時(shí)間保存，加入少許防腐劑（如0.02％NaN3）可有利于保存。保存不當(dāng)時(shí)會(huì)有細(xì)菌生長(zhǎng)或有凝集顆粒形成。少量凝集顆粒并
