細(xì)胞轉(zhuǎn)染步驟.doc

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1、細(xì)胞轉(zhuǎn)染及其篩選1.傳代：細(xì)胞于10cm盤(pán)消化后接種于6cm盤(pán)向6cm盤(pán)中加入3ml培養(yǎng)基，“米”字形搖晃。當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)到50%-70%時(shí)，根據(jù)細(xì)胞的生長(zhǎng)速度可進(jìn)行轉(zhuǎn)染2.配置轉(zhuǎn)染體系：（6cm盤(pán)）2.4ug基因載體質(zhì)粒；9ul轉(zhuǎn)染試劑；200ul無(wú)血清培養(yǎng)基?；靹蚝笫覝仂o置10-15min孵育。3.將6cm盤(pán)中的舊培養(yǎng)基棄去，換新的培養(yǎng)基3ml。4.將配置好的轉(zhuǎn)染體系加入到6cm盤(pán)中，混勻6-18h內(nèi)換液。5.12小時(shí)，換液后進(jìn)行顯微鏡拍照觀察。6.再過(guò)6h加入G418，進(jìn)行篩選（始終在6cm盤(pán)中進(jìn)行），使用G418濃度：600μg/mlG4

2、18的配置：取1gG418溶于1mlHEPES液中，加蒸餾水至10ml，過(guò)濾消毒4℃保存。7.3-5天換液一次（換液不用PBS沖洗），此時(shí)仍要加G418，濃度不變，只到細(xì)胞呈單個(gè)細(xì)胞那種，當(dāng)細(xì)胞死的過(guò)多時(shí)，可考慮藥物濃度減半。篩選出穩(wěn)定表達(dá)的cell。8.挑克隆：1制備細(xì)胞懸液，細(xì)胞計(jì)數(shù)，用培養(yǎng)基稀釋細(xì)胞到1個(gè)/10ul，在96孔板中加入培養(yǎng)基150ul/孔，在加入細(xì)胞懸液10ul/孔，待其逐漸增多后轉(zhuǎn)入24孔板、6孔板、6cm盤(pán)增殖。2.伴隨著細(xì)胞的生長(zhǎng)，可能最后會(huì)變成細(xì)胞簇，故可以用黃槍頭把細(xì)胞菌落挑出，放入24孔板里面。9.單克隆鑒定：

3、提取細(xì)胞RNA后，進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)其表達(dá)量。10.先做RT-PCR篩選一部分，在做western繼續(xù)篩選一部分。所需物品：1.轉(zhuǎn)染試劑（AttracteneTransfectionRegent）；2.96孔板；3.24孔板；4.6孔板；5.6cm盤(pán)；6.G4187.1mlHEPES液