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《lipofectamine 2000細胞轉(zhuǎn)染實驗步驟 注意事項》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在行業(yè)資料-天天文庫。
1、Invitrogen陽離子轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000細胞轉(zhuǎn)染實驗步驟注意事項2010-07-1016:16Invitrogen的細胞轉(zhuǎn)染試劑：Lipofectamine2000Lipofectamine2000是最為人熟知的轉(zhuǎn)染產(chǎn)品之一。已知可為517種細胞（見下面連接地址）提供高轉(zhuǎn)染效率（表達轉(zhuǎn)基因細胞的百分數(shù)）和活性（細胞抽提物中轉(zhuǎn)入基因的酶產(chǎn)物活性）。特點兩個關(guān)鍵性特點使得Lipofectamine2000試劑的轉(zhuǎn)染步驟快速簡便：（1）DNA-陽離子脂質(zhì)體試劑的復(fù)合體可以直接加入到細胞培養(yǎng)基中，有血清也不怕（2）轉(zhuǎn)染后不需要除去Lipofectam
2、ine2000試劑，無需換培養(yǎng)基操作流程事實上Lipofectamine系列產(chǎn)品操作流程都是又快又簡單：稀釋DNA以及Lipofectamine2000，混合2種稀釋液保溫20分鐘，加入培養(yǎng)細胞中孵育24－96小時檢測結(jié)果。下面是Invitrogen提供的詳細流程和注意事項。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化細胞并計數(shù)，細胞鋪板，使其在轉(zhuǎn)染日密度為90%。細胞鋪板在0.5ml含血清，不含抗生素的正常生長的培養(yǎng)基中。對于每孔細胞，使用50μl無血清培養(yǎng)基（如OPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基）稀釋0.8μg-1.0μgDNA。對于每孔細胞，使用50μlOPTI-MEMⅠ培養(yǎng)基稀釋1μl-3μlL
3、IPOFECTAMINE2000試劑。Lipofectamine2000稀釋后保溫5分鐘（在30分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合。保溫時間過長會降低活性。）注意：即使Lipofectamine2000使用OPTI-MEMⅠ稀釋，細胞也可以使用D-MEM培養(yǎng)。如果D-MEM做為Lipofectamine2000的稀釋液，必須在5分鐘內(nèi)同稀釋的DNA混合?；旌舷♂尩腄NA（第2步）和稀釋的Lipofectamine2000（第3步）。在室溫保溫20分鐘。注意：溶液可能會混濁，但不會影響轉(zhuǎn)染。復(fù)合物可以在室溫保持6小時穩(wěn)定。直接將復(fù)合物加入到每孔中，搖動培養(yǎng)板，輕輕混勻。注意：如果在
4、無血清條件下轉(zhuǎn)染，使用含血清的正常生長培養(yǎng)基進行細胞鋪板。在加入復(fù)合物前移去生長培養(yǎng)基，替換為0.5ml無血清培養(yǎng)基。在37℃，5％的CO2中保溫24-48小時，無須去掉復(fù)合物或更換培養(yǎng)基或者在4-5小時后更換生長培養(yǎng)基也不會降低轉(zhuǎn)染活性。在細胞中加入復(fù)合物24-72小時后，分析細胞抽提物或進行原位細胞染色，檢測報告基因活性。這依賴于細胞類型和啟動子活性。對穩(wěn)定表達，在開始轉(zhuǎn)染一天后將細胞傳代至新鮮培養(yǎng)基中，兩天后加入篩選抗生素。進行穩(wěn)定表達需要數(shù)天或數(shù)周。對于96孔板培養(yǎng)，不再需要提前一天進行細胞鋪板，而可以直接在平板中制備復(fù)合物，然后將細胞懸浮液加入到復(fù)合物就可以了
5、，這樣進一步減少了轉(zhuǎn)染時間。這種改進步驟已經(jīng)過293-H，293-F，COS-7L和CHO細胞的試驗，同傳統(tǒng)方法相比活性稍低?？旖莸牟襟E和蛋白表達細胞系的高效轉(zhuǎn)染使得Lipofectamine2000非常適用于96孔板的高通量轉(zhuǎn)染，比如cDNA文庫的篩選和蛋白瞬時表達。適用細胞株范圍不同的轉(zhuǎn)染試劑所適用的細胞株范圍各不相同。一個實驗室常常會用到不止一種細胞株，甚至是比較特殊的細胞株。一個轉(zhuǎn)染試劑所適用的細胞株越多，當然越受用戶的歡迎。根據(jù)Invotrogen網(wǎng)站的資料，Lipofectamine2000已經(jīng)證實可用于高達517種細胞株，覆蓋了相當廣的范圍。要看看Lipo
6、fectamine2000是否適用于你現(xiàn)有的細胞株，可以訪問以下Invitrogen網(wǎng)址（http://www.invitrogen.com/content.cfm?pageID=9559&fuseaction=CellLines.dsp_searchRange）適用的核酸類型和DNA大小有的轉(zhuǎn)染試劑是為siRNA轉(zhuǎn)染而設(shè)計的，有的則是為DNA轉(zhuǎn)染設(shè)計。Lipofectamine2000可以適用于包括DNA，siRNA,dsRNA,熒光標記的Oligo,RNA等在內(nèi)的核酸轉(zhuǎn)染，這使得Lipofectamine2000適用范圍非常廣泛，無論是基因表達分析的DNA轉(zhuǎn)染，或者
7、是RNAi，Lipofectamine2000都能勝任，這樣你就不需要為不同目的購買不同試劑了。值得注意的是，最常用的DNA轉(zhuǎn)染中有一個DNA大小的問題，太大的質(zhì)粒不那么好轉(zhuǎn)。我們暫時還沒有找到Lipofectamine2000相應(yīng)的資料。用量和價格好東西往往不便宜?？墒窃趯嶒炇抑?，價格往往是最具有殺傷力的。Lipofectamine2000用的劑量大嗎？價格如何？根據(jù)說明書，24孔板轉(zhuǎn)染每次用2ul左右，1.5mlLipofectamine2000大約可做750次24孔板轉(zhuǎn)染，或者大約150次6孔板轉(zhuǎn)染，而1.5mlLipofectam
