羽衣甘藍(lán)dh1代株系遺傳穩(wěn)定性研究

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1、羽衣甘藍(lán)DH1代株系遺傳穩(wěn)定性研究　　摘要：以羽衣甘藍(lán)（Brassicaoleraceavar.acephala）兩個(gè)自交系（F6代）作比較，利用ISSR標(biāo)記技術(shù)檢測了羽衣甘藍(lán)3個(gè)DH1代株系的遺傳穩(wěn)定性，并對(duì)5個(gè)群體進(jìn)行聚類分析。結(jié)果表明，3個(gè)DH1代株系DN31、DP70、DT2和兩個(gè)自交系B62、B111利用9條ISSR引物分別擴(kuò)增出55、51、50、54和51條清晰條帶，其中，多態(tài)性位點(diǎn)DN31有3個(gè)，DP70有2個(gè)，DT2沒有，B62有19個(gè)，B111有15個(gè)。羽衣甘藍(lán)DH1代株系內(nèi)基本不存在遺傳差異，基因型是純合的，兩個(gè)自交系遺傳穩(wěn)定性相對(duì)較差。表明小孢子培養(yǎng)技術(shù)在獲得

2、純合體材料上比人工自交的方法高效、快捷，而且獲得的純系基因型更純、更穩(wěn)定。關(guān)鍵詞：羽衣甘藍(lán)（Brassicaoleraceavar.acephala）；DH系；ISSR標(biāo)記；遺傳穩(wěn)定性；聚類分析中圖分類號(hào)：S635.9；S503文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A文章編號(hào)：0439-8114（2013）13-3056-038利用小孢子培養(yǎng)技術(shù)能快速獲得育種急需的遺傳穩(wěn)定材料和培育新的種質(zhì)資源，提高育種效率。小孢子培養(yǎng)所得植株加倍后獲得的雙單倍體構(gòu)成的群體稱為DH群體，從DH群體中篩選出來的株系叫DH系，DH系在遺傳上是完全純合的，可以直接作為優(yōu)良親本用于品種改良[1]?？蒲泄ぷ髡卟捎眯℃咦优囵B(yǎng)技術(shù)已獲得

3、一系列作物的優(yōu)良品系[2-4]。ISSR分子標(biāo)記具有DNA樣品用量少、操作簡單、信息量大、多態(tài)性高等優(yōu)點(diǎn)，且由于引物更長，退火溫度更高因而具有更好的可重復(fù)性和穩(wěn)定性[5]，是分析種質(zhì)遺傳多樣性和親緣關(guān)系的有效工具。很多研究均成功地利用ISSR標(biāo)記技術(shù)分析植物的遺傳變異性和遺傳關(guān)系[6-8]。羽衣甘藍(lán)（Brassicaoleraceavar.acephala）是十字花科（Cruciferae）蕓薹屬（Brassica）甘藍(lán)種的一個(gè)變種，二年生草本植物，觀葉為主，由于耐寒性強(qiáng)，觀賞期長，已成為我國廣大地區(qū)冬季及早春時(shí)節(jié)應(yīng)用最廣泛的觀賞植物之一[9]。利用游離小孢子培養(yǎng)技術(shù)開展羽衣甘藍(lán)育

4、種工作，能快速獲得育種急需的遺傳穩(wěn)定材料，提高育種效率。小孢子植株DH系基因型理論上是完全純合的，而通過多代自交也可以達(dá)到此目的。為了比較小孢子培養(yǎng)技術(shù)和人工自交分別獲得純合體材料的效率，試驗(yàn)以羽衣甘藍(lán)兩個(gè)自交系作比較，利用ISSR標(biāo)記技術(shù)檢測了羽衣甘藍(lán)3個(gè)基因型DH1代株系的遺傳穩(wěn)定性，并對(duì)5個(gè)株系進(jìn)行了聚類分析。1材料與方法1.1材料8羽衣甘藍(lán)3個(gè)基因型名古屋-紅、P3、東京-白的DH1代DN31、DP70和DT2，名古屋-紅和“K12”的自交系B62（F6代）和B111（F6代），材料來源及主要特征見表1。由羽衣甘藍(lán)小孢子培養(yǎng)獲得的植株稱為DH0代，經(jīng)DH0代自交的自交一代稱

5、為DH1代。1.2方法1.2.1DNA的提取分別從供試材料各單株上取幼嫩葉片，參照王灝等[10]的方法，用稍作改良的CTAB小量法提取基因組DNA。1.2.2ISSR擴(kuò)增ISSR引物自行設(shè)計(jì)，由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR反應(yīng)體系20μL，其中10×Buffer2μL，MgCl21.5mmol/L，dNTP0.2mmol/L，TaqDNA聚合酶1U，引物0.5μmol/L，模板DNA20ng。擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性4min；94℃變性30s，58℃復(fù)性45s，72℃延伸90s，接著梯度降溫進(jìn)行復(fù)性，5個(gè)循環(huán)后穩(wěn)定在53℃復(fù)性，進(jìn)行38個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10

6、min，擴(kuò)增產(chǎn)物在4℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠（TAE電泳緩沖液，0.5μg/L溴化乙錠）電泳檢測。在凝膠成像系統(tǒng)上觀察、拍照鑒定。1.2.3數(shù)據(jù)分析ISSR電泳結(jié)果采取0/1賦值記帶，有帶記為1，無帶記為0。對(duì)原始矩陣用SimQual程序求Jaccard相似系數(shù)矩陣，并獲得相似系數(shù)矩陣。利用PopGene32軟件計(jì)算擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性位點(diǎn)數(shù)（thenumberofpolymorphicloci，N）、多態(tài)性位點(diǎn)比率（thepercentageofpolymorphicloci，P）、Shannon多樣性指數(shù)。用NTSYS-pc82.10e軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，將由“1”和“0

7、”生成的原始矩陣用UPGMA方法進(jìn)行聚類分析，最后通過Treeplot模塊生成聚類圖。2結(jié)果與分析2.1羽衣甘藍(lán)DH1代株系ISSR標(biāo)記擴(kuò)增產(chǎn)物的多態(tài)性從38個(gè)ISSR引物中選取9個(gè)能夠獲得清晰條帶、反應(yīng)穩(wěn)定的ISSR引物（表2）。DN31、DP70、DT2每個(gè)株系各選取8株進(jìn)行ISSR標(biāo)記分析，結(jié)果表明，這3個(gè)DH1代株系9條ISSR引物分別擴(kuò)增出清晰、穩(wěn)定性好的條帶55、51和50條（圖1），大小在200～1500bp，其中多態(tài)性位點(diǎn)DN31為3個(gè)，DP70為2個(gè)