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1、標(biāo)記免疫技術(shù)鄒全明第三軍醫(yī)大學(xué)醫(yī)學(xué)檢驗系臨床微生物學(xué)和免疫學(xué)教研室標(biāo)記免疫技術(shù)=抗原抗體反應(yīng)示蹤物標(biāo)記靈敏性特異性標(biāo)記免疫技術(shù)的主要特點：高特異性、高靈敏性免疫技術(shù)+標(biāo)記技術(shù)標(biāo)記免疫技術(shù)免疫測定技術(shù)免疫組化技術(shù)示蹤物及標(biāo)記技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)放射免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光技術(shù)金免疫技術(shù)生物素-親和素免疫放大技術(shù)……第一節(jié)酶免疫技術(shù)基本原理利用酶催化底物反應(yīng)的生物放大作用,提高特異性抗原-抗體免疫學(xué)反應(yīng)的檢測敏感性的一種標(biāo)記免疫技術(shù)。基本特點：①標(biāo)記后保留酶和抗原(抗體)的活性。②酶促反應(yīng)專一性，保證特異性。
2、③底物反應(yīng)放大作用，提高敏感性。④酶標(biāo)試劑保存穩(wěn)定。⑤操作簡便，安全易行。一、酶免疫技術(shù)的分類酶免疫組化用于檢測組織切片或細(xì)胞涂片中的抗原和抗體酶免疫技術(shù)均相酶免疫測定酶免疫測定固相酶免疫測定異相酶免疫測定（ELISA）液相酶免疫測定二、酶免疫技術(shù)的技術(shù)要點（一）固相載體基本要求結(jié)合容量高，結(jié)合穩(wěn)定；可與抗原抗體復(fù)合物等大分子蛋白結(jié)合；生物大分子固化后仍保持活性；固化方法簡便易行、快捷經(jīng)濟(jì)。種類與選擇1.塑料制品2.微顆粒3.膜載體（二）酶與酶作用底物1.用于標(biāo)記酶的要求：酶活性高標(biāo)記后酶活性穩(wěn)定，且不
3、影響標(biāo)記抗原與抗體的免疫反應(yīng)性酶催化底物后信號易判定或測定酶活性不受樣品中其他成分的影響酶、輔助因子及底物理化性質(zhì)穩(wěn)定，安全無害，價廉2.常用酶及其底物（1）辣根過氧化物酶（HRP）常用底物：鄰苯二胺（OPD）：反應(yīng)顯橙黃色，應(yīng)避光，致癌性。四甲基聯(lián)苯胺（TMB）：反應(yīng)后呈藍(lán)色，無需避光，無致癌性，但水溶性差。（2）堿性磷酸酶（AP）常用底物為對硝基苯磷酸酯（p-NPP），產(chǎn)物為黃色。*AP靈敏性高與HRP，但不易獲得純品，穩(wěn)定性及酶標(biāo)記物收率低于HRP，且價高，故應(yīng)用不如HRP普及。（三）酶標(biāo)記抗體或
4、抗原基本要求：酶標(biāo)記抗原純度要高，抗原性完整；抗體的特異性好，效價高，親和力強(qiáng)，比活性高以及易于批量生產(chǎn)和分離純化。酶標(biāo)記方法1.交聯(lián)法以雙功能交聯(lián)劑為“橋”，分別與酶和抗體（抗原）連接形成結(jié)合物。如戊二醛交聯(lián)法。2.直接法用過碘酸鈉活化酶蛋白分子后，再與抗體（抗原）結(jié)合。僅適用于含糖蛋白分子的酶（如HRP）標(biāo)記物制備。（四）標(biāo)記抗體鑒定（五）免疫吸附劑（六）試劑最佳工作濃度的選擇三、酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzymelinkedimmunosorbentassay,ELISA)(一)基本原理：使抗原或抗體
5、結(jié)合到某種固相載體表面，并保持其免疫活性（固相抗原／抗體的形成）在測定時，把受檢標(biāo)本（測定其中的抗體或抗原）和酶標(biāo)抗原或抗體按不同的步驟與固相載體表面的抗原或抗體起反應(yīng)（抗原抗體反應(yīng)）用洗滌的方法使固相載體上形成的抗原抗體復(fù)合物與其他物質(zhì)分開，最后結(jié)合在固相載體上的酶量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量成一定的比例。（酶標(biāo)抗原抗體復(fù)合物的分離）加入底物后，底物被酶催化變?yōu)橛猩a(chǎn)物，產(chǎn)物的量與標(biāo)本中受檢物質(zhì)的量直接相關(guān)，故可根據(jù)顏色反應(yīng)的深淺進(jìn)行定性或定量分析。（顯色反應(yīng)）（二）ELISA技術(shù)類型：ELISA可用于測定
6、抗原，也可用于測定抗體，在這種測定方法中有3種必要的試劑：固相的抗原或抗體，酶標(biāo)記的抗原或抗體，酶作用的底物。1．雙抗體夾心法特點：非競爭結(jié)合反應(yīng)常用于抗原的檢測適用于分子中具有至少兩個抗原決定簇的多價抗原，而不能用于小分子半抗原的檢測所用兩種抗體分別針對同一個抗原分子的不同抗原決定簇2．間接法3.競爭法特點：用于抗原和半抗原的定量測定，也可對抗體進(jìn)行測定。酶標(biāo)Ag（Ab）與樣品或標(biāo)準(zhǔn)品中的非標(biāo)記Ag（Ab）具有相同的與固相Ab(Ag)結(jié)合的能力。反應(yīng)體系中，固相Ab（Ag）和酶標(biāo)Ag（Ab）是固定限量
7、的，且前者的結(jié)合位點少于酶標(biāo)記與非標(biāo)記Ag（Ab）的分子數(shù)量和。反應(yīng)后，結(jié)合與固相載體上復(fù)合物中被測定的酶標(biāo)Ag（Ab）的量（酶活性）與樣品中非標(biāo)記Ag（Ab）的濃度成反比。4.捕獲法（反向間接法）主要用于血清中某種抗體亞型成分（如IgM）的測定。注意事項：加樣應(yīng)將所加物加在ELISA板孔的底部，避免加在孔壁上部，并注意不可濺出，不可產(chǎn)生氣泡。保溫1、一般均采用水浴箱，使溫度迅速平衡。2、為避免蒸發(fā)，板上應(yīng)加蓋，也可用塑料貼封紙或保鮮膜覆蓋板孔。洗滌：決定著實驗的成敗。目的：洗去反應(yīng)液中沒有與固相抗原或
8、抗體結(jié)合的物質(zhì)以及在反應(yīng)過程中非特異性吸附于固相載體的干擾物質(zhì)。洗滌的方式除某些ELISA儀器配有特殊的自動洗滌儀外，手工操作有浸泡式和流水沖洗式兩種。比色比色前應(yīng)先用潔凈的吸水紙拭干板底附著的液體，然后將板正確放入酶標(biāo)比色儀的比色架中。用特定的波長測讀吸光值。 比色結(jié)果的表達(dá)以往通用光密度（opticaldensity，OD），現(xiàn)按規(guī)定用吸光度（absorbence，A），兩者含義相同。通常的表示方法是，將吸收波長寫于A字母的右下角，如O
