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1、sTRAIL真核表達載體的構(gòu)建及其對C6膠質(zhì)瘤細胞增殖影響的體外實驗研究作者：李谷馬力龔江標徐錦芳楊小鋒詹仁雅【摘要】 目的 構(gòu)建重組基因表達載體PcDNA-sTRAIL并觀察其對C6膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用。方法通過PCR擴增和定向克隆技術(shù)構(gòu)建重組真核表達載體PcDNA-sTRAIL。以陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細胞并用流式細胞儀觀測對細胞增殖的影響。結(jié)果經(jīng)過測序鑒定和蛋白表達檢測證實，重組真核表達載體PcDNA-sTRAIL構(gòu)建成功。陽離子脂質(zhì)體介導(dǎo)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染C6膠質(zhì)瘤細胞陽性率達50%。脂質(zhì)體PcDNA-sTRAIL轉(zhuǎn)染C6細
2、胞后,相比未轉(zhuǎn)染、空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染、Lipofectin轉(zhuǎn)染組C6膠質(zhì)瘤細胞增殖抑制、細胞凋亡明顯增加（t分別=9.52、7.20、2.84,P均<0.05）。結(jié)論成功構(gòu)建了sTRAIL基因的真核表達載體，并從體外實驗中初步證實了其對C6膠質(zhì)瘤細胞增殖具有明顯的抑制作用?！娟P(guān)鍵詞】膠質(zhì)瘤基因治療真核表達載體轉(zhuǎn)染 目前膠質(zhì)瘤的治療是以手術(shù)為主的綜合治療，并輔以術(shù)前術(shù)后的放射治療和化學(xué)治療。但總體療效尚不理想[1]。基因治療被認為是繼以上治療手段后具有良好效果的新的治療手段?？扇苄阅[瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體（solubletumorne
3、crosisfactorrelatedapoptosisinducingligands，sTRAIL）自發(fā)現(xiàn)并成功地克隆出來已被證實存在明確的抗腫瘤效果，為中樞神經(jīng)系統(tǒng)的腫瘤治療帶來了新的希望[2]。本次研究構(gòu)建重組基因表達載體PcDNA-sTRAIL并觀察其對C6膠質(zhì)瘤細胞的抑制作用，為膠質(zhì)瘤治療的進一步研究提供基礎(chǔ)?！ ? 材料與方法 1.1 材料 1.1.1 試劑及儀器 大鼠C6膠質(zhì)瘤細胞系（由上海生化與細胞生物學(xué)研究所提供）；Lipofectin（由美國Gibco公司生產(chǎn)）；AccessRT-PCRSystem(由美國P
4、romega公司生產(chǎn))；PcDNA(由美國Invotrigen公司生產(chǎn))；PUCm－T載體、凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒（由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)）；流式細胞儀、BioER基因擴增儀（由美國Becton-Dickinson公司生產(chǎn)）；NS25OLYMPUS倒置顯微鏡（由日本OLYMPUS公司生產(chǎn)）；垂直電泳儀和半干電轉(zhuǎn)儀（由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)）；基因脈沖儀及酶標儀（由美國Bio-Rad公司生產(chǎn)）?！ ?.2 實驗方法 1.2.1 sTRAIL的基因克隆及PcDNA-sTRAIL重組表達載體建立 Trizol
5、一步法提取總RNA，以提取液作為模板采用cDNA逆轉(zhuǎn)錄與PCR擴增一步法試劑盒進行RT-PCR反應(yīng)得到DNA并純化。引物設(shè)計如下： 上游：5-GCGAATTCAGTATGGTGAGAGAAA－GAGGTC-3（含有EcoRⅠ酶切位點） 下游：5-ACAGTAGGATCCTCCAGGTCAGTTA－GCCA-3（含有BamHⅠ酶切位點） 20ul反應(yīng)體系中進行PCR反應(yīng)，循環(huán)條件設(shè)置如下：95℃3min1個循環(huán)；94℃1min，55℃1min，72℃1min30s35個循環(huán)；72℃8min1個循環(huán)；4℃維持。用EcoRI和Bam
6、HI分別對載體PUCm-T和外源DNA雙酶切，純化后連接，構(gòu)建T-sTRAIL質(zhì)粒。T-sTRAIL質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌TGI，用含有Amp抗性的LB培養(yǎng)基篩選質(zhì)粒。堿裂解法抽提質(zhì)粒T-sTRAI，用EcoRI和BamHI雙酶切后凝膠電泳觀察目的片段sTRAIL長度后并送上海生工公司進行序列測定。鑒定無誤后將PcDNA3.1和T-sTRAIL分別用EcoRI和BamHI雙酶切并分離純化后用T4連接酶連接，完成重組表達載體PcDNA-sTRAIL的構(gòu)建并測序驗證。提取前述大腸桿菌菌落利用Westernblotting進行目標蛋白鑒定?！?/p>
7、 1.2.2 轉(zhuǎn)染sTRAIL基因?qū)6膠質(zhì)瘤細胞增殖影響的體外研究 PcDNA-sTRAIL質(zhì)粒體外擴增后利用陽離子脂質(zhì)體法介導(dǎo)PcDNA-sTRAIL質(zhì)粒載體導(dǎo)入C6細胞。實驗組：分別以DMEM無血清培養(yǎng)基稀釋5ugDNA和5ulLipofectin至100ul，兩者混勻后轉(zhuǎn)移到經(jīng)胰酶消化無血清培養(yǎng)的C6細胞培養(yǎng)瓶中，完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24～48h后，在顯微鏡下觀察細胞生長情況；對照組1：以同體積的PcDNA3.1代替DNA溶液；對照組2：以同體積的Lipofectin代替DNA溶液，其它操作與實驗組相同；以上三組轉(zhuǎn)染細胞培養(yǎng)4
8、8h后傳代培養(yǎng)于含G418的濃度梯度培養(yǎng)液中進行抗性篩選穩(wěn)定表達sTRAIL的C6細胞，用免疫組化染色對表達sTRAIL基因的C6細胞進行鑒定。采用流式細胞技術(shù)（finitestatemachine，F(xiàn)CM）的Pl染色法對成功轉(zhuǎn)染Pc
