ING4真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG增殖的影響

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1、ING4真核表達(dá)載體的構(gòu)建及對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG增殖的影響作者姓名（排序）：李曉梅作者單位：哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院第一作者姓名及身份證號(hào)碼：李曉梅230204197304071424通訊作者姓名：耿敬姝1研究背景INGs（INhibitorofGrowth腫瘤生長(zhǎng)抑制因子）是近些年發(fā)現(xiàn)一個(gè)腫瘤抑制基因家族，包括ING1、ING2/ING12L、ING3、ING4、ING5和三種釀酒酵母INGs（Yng1、Yng2、及Pho23）,它們彼此之間保持較高的同源性。ING4基因是新近發(fā)現(xiàn)的ING基因家族的新成員，定位于人12q13-32，由8個(gè)外顯子和7個(gè)內(nèi)含子

2、組成，編碼248個(gè)氨基酸分子。其功能可能與負(fù)性調(diào)節(jié)細(xì)胞生長(zhǎng)和接觸抑制及血管生成有關(guān)。國(guó)外研究發(fā)現(xiàn)，多種腫瘤中可發(fā)現(xiàn)存在ING4基因的異常或ING4蛋白表達(dá)的降低，如乳腺癌、直腸癌、宮頸癌、小細(xì)胞肺癌、惡性膠質(zhì)瘤及頭頸部鱗狀細(xì)胞癌等。研究證實(shí)ING4基因編碼蛋白的表達(dá)水平隨著腦膠質(zhì)瘤惡性程度的增高而降低。ING4基因在正常腦膠質(zhì)細(xì)胞中比低度惡性腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平高2～3倍，比高度惡性腦膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平高6倍。我們有理由推測(cè)ING4基因的異常及蛋白表達(dá)降低與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展有關(guān)。已研究證實(shí)，該因子對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤的基因治療具有潛在的重要價(jià)值。為了進(jìn)一步研究該因子對(duì)膠質(zhì)

3、瘤的治療價(jià)值，我們首先構(gòu)建真核表達(dá)載體pcDNA3.1-ING4,并利用脂質(zhì)體Lipofectamine2000將其轉(zhuǎn)入U(xiǎn)87MG細(xì)胞，通過檢測(cè)ING4基因的表達(dá)的改變及膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG細(xì)胞增殖所發(fā)生的改變，推測(cè)證實(shí)ING4對(duì)U87MG細(xì)胞增殖的影響，并進(jìn)一步探討ING4抑制腫瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制是否與p53及cyclinB1有關(guān)。材料與方法ING4基因的克隆、序列測(cè)定和真核表達(dá)載體的構(gòu)建。引物設(shè)計(jì)→擴(kuò)增目的基因片段→目的基因ING4克隆及真核載體pcDNA3.1-ING4的構(gòu)建→重組質(zhì)粒的抽提純化、測(cè)序和鑒定。2.U87MG細(xì)胞培養(yǎng)、ING4基因轉(zhuǎn)染、篩選和表

4、達(dá)。U87MG細(xì)胞采用DMEM10%進(jìn)口小牛血清培養(yǎng)→用Lipofectamine2000將pcDNA3.1-ING4質(zhì)粒和空載pcDNA3.1質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染U87MG細(xì)胞→在G418壓力下篩選，建立穩(wěn)定表達(dá)ING4細(xì)胞模型→提取轉(zhuǎn)染ING4克隆細(xì)胞基因及總蛋白，挑選高表達(dá)ING4蛋白的U87MG細(xì)胞。3.ING4對(duì)U87MG細(xì)胞增殖影響的多方面研究。①細(xì)胞計(jì)數(shù)及生長(zhǎng)曲線繪制②細(xì)胞集落形成計(jì)數(shù)③MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)情況④觀察ING4對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87MG放射治療的是否有增敏作用※以上實(shí)驗(yàn)均以轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的細(xì)胞作為對(duì)照。實(shí)驗(yàn)④給予6000GYγ射線下連續(xù)照射。4.I

5、NG4抑制U87MG細(xì)胞增殖的機(jī)制的研究。設(shè)計(jì)P53及cyclinB1的引物，采用PCR進(jìn)行基因擴(kuò)增；應(yīng)用Western-blot方法提取細(xì)胞中的總蛋白，檢測(cè)分別轉(zhuǎn)染目的基因ING4質(zhì)粒及空載質(zhì)粒U87MG細(xì)胞中ING4、P53及cyclinB1基因蛋白表達(dá)情況，均以GAPDH為內(nèi)參照。結(jié)果1.經(jīng)測(cè)序成功擴(kuò)增出未發(fā)生基因突變的正確的ING4功能片段，大小為750bp。2.ING4在轉(zhuǎn)染目的基因質(zhì)粒U87MG細(xì)胞中的表達(dá)增高。3.繪制生長(zhǎng)曲線、集落形成試驗(yàn)、MTT檢測(cè)顯示轉(zhuǎn)染ING4的瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受抑。見圖1.2.34.ING4增強(qiáng)U87MG細(xì)胞對(duì)放射治療的敏感性.

6、見圖4.圖1圖2圖3圖45.轉(zhuǎn)染ING4的U87MG細(xì)胞P53（圖1）及cyclinB1（圖2.3）的表達(dá)降低。圖1圖2圖3討論Gong等在2004年發(fā)現(xiàn)ING4是一種信號(hào)分子，可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的存活、生長(zhǎng)。ING4的表達(dá)在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中與正常腦組織比較是降低的，其表達(dá)水平由低級(jí)別腫瘤到高級(jí)別腫瘤是逐漸下調(diào)的，提示ING4表達(dá)下降可能與膠質(zhì)腫瘤的發(fā)生有一定關(guān)系。我們構(gòu)建ING4真核表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染低表達(dá)ING4的U87MG細(xì)胞，并通過與轉(zhuǎn)染空載質(zhì)粒的瘤細(xì)胞進(jìn)行對(duì)照，發(fā)現(xiàn)無論是在基因水平還是蛋白水平轉(zhuǎn)染ING4質(zhì)粒的U87MG細(xì)胞能夠穩(wěn)定高表達(dá)ING4蛋白。同時(shí)我們

7、進(jìn)行了幾種反映腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)增殖速度的實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明轉(zhuǎn)染ING4的瘤細(xì)胞生長(zhǎng)受到了明顯的抑制，同時(shí)發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ING4瘤細(xì)胞在射線照射下致死率明顯高于空載細(xì)胞，說明ING4能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)，可以提高瘤細(xì)胞對(duì)射線的敏感性。ING4是一種核蛋白，其C端具有核定位信號(hào)與p53復(fù)合定位于細(xì)胞核內(nèi)。p53是一種多功能蛋白，它的基本功能是作為轉(zhuǎn)錄反式作用因子調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄活性。研究表明ING4功能的發(fā)揮是P53依賴的，在我們的研究中發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染ING4質(zhì)粒后瘤細(xì)胞中P53的表達(dá)沒有增加，是降低的，這說明ING4不是P53的上游基因，ING4表達(dá)增強(qiáng)并不引起P53水平增高，可能通

8、過調(diào)節(jié)P53下游某種基因