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《hbvx基因真核表達載體的構(gòu)建及對肝癌細胞惡性表型的影響》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在應(yīng)用文檔-天天文庫。
1、HBVx基因真核表達載體的構(gòu)建及對肝癌細胞惡性表型的影響 摘要:目的構(gòu)建乙型肝炎病毒x基因真核表達載體并在肝癌細胞中表達，以研究其對肝癌細胞惡性表型的影響.方法應(yīng)用PCR、基因克隆等方法構(gòu)建乙型肝炎病毒x基因真核表達載體pcDNA3.1-HBX，用基因轉(zhuǎn)染的方法將pcD-NA3.1-HBX轉(zhuǎn)染入肝癌細胞HCC-9204，篩選穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌細胞.MTT比色實驗、平板集落形成實驗檢測肝癌細胞惡性表型.結(jié)果成功構(gòu)建了乙型肝炎病毒x基因真核表達載體pcDNA3.1-HBX并獲得了穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌細胞系HCC-9204細胞克隆，且MTT比色實驗、平板克隆
2、形成實驗顯示穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X蛋白的肝癌細胞惡性度增高.結(jié)論乙型肝炎病毒X蛋白具有生長因子樣作用，可刺激肝癌細胞生長，在肝癌細胞中穩(wěn)定表達乙型肝炎病毒X蛋白可增加肝癌細胞惡性表型. Keyacell Abstract:AIMToconstructandexpresstheeukaryoticex-pressionvectorofHBVxgeneandstudyitseffectonthema-lignantphenotypeofhepatocellularcarcinomacells.METHODSPolymerasechainreaction（PCR）andotherm
3、olecularbiologicalmethodsediatedbythelipofectamineanhepatocellularcarcinomacelllineHCC-9204.TheselectivemediumcontainingG418etricanalysisexperimentandagarosecolony-formingalignantphenotypeandgroacells.RESULTSTheeukaryoticexpressionvectorofHBVxgeneediumcontainingG418.Cellsalignantphenotype.CON
4、CLUSIONTheXproteinhasgroulatethegroacellsandenhanceitsmalignantphe-notype. 0引言 乙型肝炎病毒（HBV）相關(guān)的原發(fā)性肝癌發(fā)病率和死亡率都很高，HBV與原發(fā)性肝癌之間存在著密切的關(guān)系.闡明二者的關(guān)系將對探討HBV相關(guān)的原發(fā)性肝癌的發(fā)生、發(fā)展、預防及治療具有重要意義.為此，本研究首先構(gòu)建了HBVx基因真核表達載體，并通過基因轉(zhuǎn)染技術(shù)轉(zhuǎn)染至人HCC-9204肝癌細胞，經(jīng)過藥物篩選獲得穩(wěn)定表達HBVX蛋白的細胞克隆，觀察肝癌細胞在轉(zhuǎn)染外源性HBVx基因后細胞惡性表型的變化. 1材料和方法 1.1材料人肝癌
5、細胞系HCC-9204為病理學教研室建株.肝癌細胞取自60歲男性肝癌患者手術(shù)標本，病理診斷為肝細胞肝癌Ⅱ～Ⅲ級.MTT購自Sigma公司，TaqDNA聚合酶、G418購自Promega公司，EcoRI，KpnI，BamHI，T4DNA連接酶為華美公司產(chǎn)品，兔抗HBx多克隆抗體購自美國FoxChase癌癥中心，地高辛DNA隨機引物標記試劑盒購自德國寶靈曼公司，HBVx基因PCR引物由上海生工生物工程公司合成. 1.2HBVx基因克隆及序列測定 1.2.1PCR法從質(zhì)粒pTTHK中擴增HBVx基因模板為含HBVDNA的質(zhì)粒pTTHK，分別在PCR引物的上游引物和下游引物的5’端加
6、上相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶KpnI和EcoRI酶切位點，引物順序如下:上游引物5’ATCGGTACCATGGCTGC-TAGGCTG3’;下游引物5’GGAGAATTCAT-GATTAGGCAGAGGTG3’.應(yīng)用上述引物對模板DNA進行PCR，按下列條件在PCR自動擴增儀上進行PCR.94℃5min→59℃1min→74℃1min，循環(huán)30次后，74℃延伸10min.陰性對照除不含模板DNA外，其他成分與實驗組相同. 1.2.2PCR產(chǎn)物與克隆載體pT7Blue連接先用EcoRV將克隆載體pT7Blue切成線性，然后將回收的PCR產(chǎn)物HBxDNA片段接于克隆載體pT7-Blue.取
7、連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化感受態(tài)細菌DH5α大腸桿菌，挑選單菌落，篩選重組體. 1.2.3篩選重組體pT7Blue-HBX取上述質(zhì)粒用EcoRI和KpnI雙酶切鑒定. 1.2.4序列測定選擇酶切結(jié)果正確的細菌菌落，提取質(zhì)粒DNA并純化.用紫外分光光度計測定DNA濃度，將5～10μg質(zhì)粒DNA溶于三蒸水，用DNA自動測序儀進行序列測定. 1.2.5真核表達載體pcDNA3.1-HBX的構(gòu)建將已經(jīng)過序列測定的重組質(zhì)粒pT7Blue-HBX及真核表達載體pcDNA3.1分別用EcoRI和Kpn
