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《peg10基因sirna真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對肝癌hepg2細(xì)胞凋亡的影響論文》由會員上傳分享，免費在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、PEG10基因siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對肝癌HepG2細(xì)胞凋亡的影響論文【關(guān)鍵詞】PEG10基因；RNA干擾；表達(dá)載體【Abstract】AIM:ToconstructthesiRNAeukaryoticexpressionvectorsofPEG10geneandtoinvestigatetheirapoptosisinducingeffectontransfectedHepG2cellsinvitro.METHODS:ThreespecificsiRNAsofPEG10ine2000.Realtimequantitative
2、PCReasurethePEG10mRNAexpressioninHepG2.Thecellgroetryandconfocalmicroscopy.RESULTS:ThreespecificsiRNAeukaryoticexpressionvectors(siRNA1,siRNA2,siRNA3)targetingPEG10RNAtovaryingdegrees.TheexpressionofPEG10mRNAarkablyinhibitedat48haftertransfection,andsiRNA2resultedinthehi
3、ghestinhibitionrate(93.99%).HepG2groega公司）；optiMEM和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（美國Invitrogen公司）；高純質(zhì)粒提取試劑盒（杭州Vgene公司）；DNA凝膠回收試劑盒（上海華舜生物工程公司）；人AnnexinVFITC試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）.FACSort流式細(xì)胞儀（BactonDickinson公司）；FV500共聚焦顯微鏡（Olympus公司）；MultiskanMk3酶標(biāo)儀（ThermoLabsystems公司）.1.2方法1.2.1siRNA靶
4、序列的設(shè)計利用GenBank檢索PEG10mRNA（錄入號：AB049834）全長序列，遵循siRNA的設(shè)計原則，通過Invivogen公司提供的siRNAgCl2溶液3μL，10×PCR緩沖液2.5μL，SYBRGreenI6.25μL，去離子水補(bǔ)至25μL.PCR擴(kuò)增條件94℃變性5min，35個PCR循環(huán)（94℃20s；58℃20s；72℃20s），72℃延伸5min，75℃時檢測熒光信號，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.引物序列：PEG10，上游:5′CCAAGTCGCTGTCTGCTCTGA3′，下游:5′GCGTAGTGACCTCCTGTTC
5、CA3′；βactin，上游:5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，下游:5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′.根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到PEG10基因及βactin表達(dá)的相對濃度，以PEG10基因與βactin相對濃度的比值來反映PEG10表達(dá)量.每個樣品做2個平行管，實驗重復(fù)3次.使用RotorGene6.0分析軟件對實驗結(jié)果進(jìn)行分析.PEG10表達(dá)抑制率(%)=（1-轉(zhuǎn)染組PEG10表達(dá)量/對照組PEG10表達(dá)量）×100％.1.2.5MTT法檢測細(xì)胞增殖取對數(shù)生長期HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1日以1×104/孔接
6、種96孔板，將重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72，96，120h后分別加入5g/LMTT20μL，37℃避光孵育4h，棄去培養(yǎng)基，加入100μLDMSO，避光30min，待其完全溶解后，用酶標(biāo)儀測定A490nm值.以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為陰性對照，實驗重復(fù)3次，細(xì)胞生長抑制率(%)＝（1-轉(zhuǎn)染組吸光度值/對照組吸光度值）×100％.1.2.6流式細(xì)胞儀檢測凋亡率收集轉(zhuǎn)染48h的HepG2細(xì)胞，PBS洗滌并重懸細(xì)胞，750mL/L冰乙醇固定1h，PBS沖洗后加入終濃度為50mg/L的碘化吡啶(PI)和終濃度為100mg/L
7、的RNaseA，避光30min后，上機(jī)檢測.1.2.7共聚焦顯微鏡檢測將PBS洗滌轉(zhuǎn)染48h的HepG2細(xì)胞，加入250μL結(jié)合緩沖液，再加入5μLAnnexinV/FITC，混勻后于室溫避光孵育10～15min，加入20mg/L的PI10μL，室溫避光孵育5～10min，在共聚焦顯微鏡下觀察并拍照.統(tǒng)計學(xué)分析：采用SPSS11.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，P0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義.2結(jié)果2．1psiRNAhH1neo重組質(zhì)粒測序鑒定取白色克隆菌液送上海英駿生物公司測序鑒定，結(jié)果顯示
8、插入的siRNA1，siRNA2和siRNA3片段已正確連入psiRNAhH1neo載體，重組質(zhì)粒構(gòu)建成功.2．2siRNA表達(dá)載體對PEG10基因mRNA的抑制作用實時定量PCR結(jié)果顯示，未轉(zhuǎn)染組、空質(zhì)粒
