peg10基因sirna真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)

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1、PEG10基因siRNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建及其對(duì)【關(guān)鍵詞】PEG10基因；RNA干擾；表達(dá)載體　　【Abstract】AIM:ToconstructthesiRNAeukaryoticexpressionvectorsofPEG10geneandtoinvestigatetheirapoptosisinducingeffectontransfectedHepG2cellsinvitro.METHODS:ThreespecificsiRNAsofPEG10ine2000.RealtimequantitativePCReasuretheP

2、EG10mRNAexpressioninHepG2.Thecellgroetryandconfocalmicroscopy.RESULTS:ThreespecificsiRNAeukaryoticexpressionvectors(siRNA1,siRNA2,siRNA3)targetingPEG10RNAtovaryingdegrees.TheexpressionofPEG10mRNAarkablyinhibitedat48haftertransfection,andsiRNA2resultedinthehighestinhibit

3、ionrate(93.99%).HepG2groega公司）；optiMEM和轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine2000（美國(guó)Invitrogen公司）；高純質(zhì)粒提取試劑盒（杭州Vgene公司）；DNA凝膠回收試劑盒（上海華舜生物工程公司）；人AnnexinVFITC試劑盒（深圳晶美生物工程有限公司）.FACSort流式細(xì)胞儀（BactonDickinson公司）；FV500共聚焦顯微鏡（Olympus公司）；MultiskanMk3酶標(biāo)儀（ThermoLabsystems公司）.　　1.2方法　　1.2.1siRNA靶序列的設(shè)計(jì)利用

4、GenBank檢索PEG10mRNA（錄入號(hào)：AB049834）全長(zhǎng)序列，遵循siRNA的設(shè)計(jì)原則，通過Invivogen公司提供的siRNAine2000說明書進(jìn)行.根據(jù)是否進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的不同分為6組.即空白對(duì)照組(不進(jìn)行轉(zhuǎn)染的同期培養(yǎng)的HepG2細(xì)胞),空質(zhì)粒組(轉(zhuǎn)染psiRNAhH1neo空質(zhì)粒),siRNA1組、siRNA2組和siRNA3組(分別轉(zhuǎn)染3個(gè)重組質(zhì)粒siRNA1，siRNA2和siRNA3),非特異性siRNA組(轉(zhuǎn)染重組的非特異性siRNA質(zhì)粒).　　1．2．4實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)PEG10表達(dá)將重組質(zhì)

5、粒和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞并培養(yǎng)48h后用Trizol試劑提取各組1×107細(xì)胞總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA第1鏈，然后以cDNA為模板，分別對(duì)PEG10基因及βactin進(jìn)行RealtimePCR反應(yīng)，反應(yīng)體系為：cDNA1μL，20μmol/L的上下游引物各0.5μL，dNTP混合液3μL，TaqDNA聚合酶3U，MgCl2溶液3μL，10×PCR緩沖液2.5μL，SYBRGreenI6.25μL，去離子水補(bǔ)至25μL.PCR擴(kuò)增條件94℃變性5min，35個(gè)PCR循環(huán)（94℃20s；58℃20s；72℃20s），72℃延伸5

6、min，75℃時(shí)檢測(cè)熒光信號(hào)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線.引物序列：PEG10，上游:5′CCAAGTCGCTGTCTGCTCTGA3′，下游:5′GCGTAGTGACCTCCTGTTCCA3′；βactin，上游:5′CCTGTACGCCAACACAGTGC3′，下游:5′ATACTCCTGCTTGCTGATCC3′.根據(jù)繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線得到PEG10基因及βactin表達(dá)的相對(duì)濃度，以PEG10基因與βactin相對(duì)濃度的比值來反映PEG10表達(dá)量.每個(gè)樣品做2個(gè)平行管，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次.使用RotorGene6.0分析軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析.PEG

7、10表達(dá)抑制率(%)=（1-轉(zhuǎn)染組PEG10表達(dá)量/對(duì)照組PEG10表達(dá)量）×100％.　　1.2.5MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期HepG2細(xì)胞，轉(zhuǎn)染前1日以1×104/孔接種96孔板，將重組質(zhì)粒和空質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞中，繼續(xù)培養(yǎng)24，48，72，96，120h后分別加入5g/LMTT20μL，37℃避光孵育4h，棄去培養(yǎng)基，加入100μLDMSO，避光30min，待其完全溶解后，用酶標(biāo)儀測(cè)定A490nm值.以空質(zhì)粒轉(zhuǎn)染組作為陰性對(duì)照，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，細(xì)胞生長(zhǎng)抑制率(%)＝（1-轉(zhuǎn)染組吸光度值/對(duì)照組吸光度值）×100％.　　1.2.

8、6流式細(xì)胞儀檢測(cè)凋亡率收集轉(zhuǎn)染48h的HepG2細(xì)胞，PBS洗滌并重懸細(xì)胞，750mL/L冰乙醇固定1h，PBS沖洗后加入終濃度為50mg/L的碘化吡啶(PI)和終濃度為100mg/L的RNaseA，避光30min后，上