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《sirna真核表達(dá)載體阻斷hela細(xì)胞stathmin基因表達(dá)研究》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線(xiàn)閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫(kù)。
1、SiRNA真核表達(dá)載體阻斷HeLa細(xì)胞stathmin基因表達(dá)研究作者：王燕，吳冰，蘇海川，劉麗，林芳，張惠中【關(guān)鍵詞】真核表達(dá)載體BlockingeffectofvectorbasedsiRNAonstathmingeneexpressioninhumanHeLacells 【Abstract】AIM:ToexploretheblockingeffectofsiRNAontheexpressionofstathmingeneinHeLacelllineusingsiRNAeukaryoticexpressionvector.METHODS:TinsiRNAcDNAsingen
2、esequenceandclonedintothevectorpSilencer4.1CMVneoandnamedpSilencerS1andpSilencerS2respectively,entsingeneexpression.CONCLUSION:ThevectorbasedsiRNAonstathmingenecaneffectivelyknockdoingeneexpression,alignanttumors. 【Keyin;RNA,smallinterfering;eukaryoticexpressionvector;HeLacells 【摘要】目的：構(gòu)建人st
3、athmin基因的siRNA真核表達(dá)載體，探討其對(duì)HeLa細(xì)胞中stathmin基因表達(dá)的干涉作用.方法：將合成的siRNA寡核苷酸鏈退火形成雙鏈，連接入經(jīng)BamHⅠ和HindⅢ雙酶切后的pSilencer4.1CMVneo真核表達(dá)載體，酶切及測(cè)序鑒定.脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒入HeLa細(xì)胞，G418篩選后RTPCR檢測(cè)其對(duì)stathmin基因mRNA的干涉效果.結(jié)果：經(jīng)酶切及測(cè)序鑒定，成功構(gòu)建siRNA真核表達(dá)載體.經(jīng)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后，RTPCR顯示所構(gòu)建的干涉stathmin基因的真核表達(dá)載體成功地抑制了目的基因的表達(dá)，HeLa細(xì)胞中stathmin基因的mRNA表達(dá)水平
4、明顯降低.結(jié)論：成功構(gòu)建了人stathmin基因的RNA干涉真核表達(dá)載體pSilencerS1和pSilencerS2，并在HeLa細(xì)胞中有效地發(fā)揮了對(duì)stathmin基因表達(dá)的干涉作用. 【關(guān)鍵詞】stathmin；RNA，小分子干擾；真核表達(dá)載體；HeLa細(xì)胞 0引言 Stathmin為一種高度保守的細(xì)胞內(nèi)蛋白，在多種惡性腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，研究表明［1，2］通過(guò)應(yīng)用反義核酸、單克隆抗體、核酶、stathmin蛋白抑制劑及絲氨酸位點(diǎn)突變體等方法封閉該基因表達(dá)均證實(shí)，抑制其表達(dá)可使細(xì)胞受阻于G2/M期，同時(shí)還可以使惡性腫瘤表型發(fā)生逆轉(zhuǎn).因此，stathmin是一個(gè)極具吸引力
5、的惡性腫瘤生物治療新靶點(diǎn).RNA干涉是最新的基因敲除技術(shù)，具有高效性和特異性，能夠降解與之序列相對(duì)應(yīng)的細(xì)胞內(nèi)mRNA,使基因轉(zhuǎn)錄后沉默.許多學(xué)者［3-5］認(rèn)為該技術(shù)的出現(xiàn)是基因功能研究及基因治療研究手段的又一次革命性突破.本試驗(yàn)通過(guò)構(gòu)建針對(duì)stathmin基因的siRNA真核表達(dá)載體，以阻斷腫瘤細(xì)胞內(nèi)stathmin基因的表達(dá)，探討腫瘤基因治療新的模式. 1材料和方法 1.1材料 質(zhì)粒提取試劑盒（inipreps DNA Purification System）,pGEMTeasy載體連接試劑盒，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒ReverseTranscriptionSystem購(gòu)自Prome
6、ga公司.pSilencer4.1CMVneo載體及陰性對(duì)照pSilencer4.1CMVneonegtivecontrol為Ambion公司產(chǎn)品.限制性?xún)?nèi)切酶BamHⅠ和HindⅢ為T(mén)akara公司產(chǎn)品，Lipofectamine2000購(gòu)自Invitrogen公司.TaqDNA聚合酶，DGL2000DNAMarker及瓊脂糖凝膠購(gòu)自鼎國(guó)生物技術(shù)有限公司.HeLa細(xì)胞及宿主菌株大腸桿菌JM109為本實(shí)驗(yàn)室保存. 1.2方法 1.2.1針對(duì)stathmin基因的siRNAcDNA設(shè)計(jì)和制備根據(jù)GenBank中stathmin基因的序列及siRNA設(shè)計(jì)原則，在編碼區(qū)內(nèi)選擇兩段1
7、9nt(分別位于基因序列中：398417;540559)作為不同的干涉區(qū)域，分別進(jìn)行BLAST分析.根據(jù)RNA干涉載體pSilencer4.1CMVneo的要求分別于上、下游引入BamHⅠ和HindⅢ酶切位點(diǎn).每段各設(shè)計(jì)一對(duì)55個(gè)堿基的序列，由博亞生物技術(shù)有限公司合成.兩對(duì)stathmin基因的siRNAcDNA序列如下：5′GGATCCGAAACGAGAGCACGAGAAATTCAAGAGATTTCTCGTGCTCTCGTTTCAGAAGCTT3′，互補(bǔ)鏈為：5′AAGCTTC
