特異性沉默eca109細胞系stathmin基因sirna表達載體的構(gòu)建

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1、特異性沉默Eca109細胞系stathmin基因siRNA表達載體的構(gòu)建：王峰，王留興，王瑞林，樊青霞，趙培榮【摘要】目的構(gòu)建并篩選特異性沉默stathmin基因的pSUPERS逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定表達的細胞克隆。方法用DNA重組技術(shù)，將64nt能轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生靶向stathmin小發(fā)夾RNA（shRNA）的寡核苷酸序列，定向克隆入逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPEREGFP，應(yīng)用脂質(zhì)體將重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體pSUPERS轉(zhuǎn)染細胞系Eca109，G418篩選建立穩(wěn)定產(chǎn)生逆轉(zhuǎn)錄病毒的細胞克隆，RTPCR檢測轉(zhuǎn)染細胞stathminmRNA的表達。結(jié)果重組逆轉(zhuǎn)錄病毒載體

2、經(jīng)EcoRⅠ、HindⅢ雙酶切，可見4692nt和285nt條帶；測序結(jié)果表明插入序列正確；重組載體轉(zhuǎn)染Eca109細胞，可表達綠色熒光蛋白（EGFP），經(jīng)G418篩選得到抗性細胞克隆，轉(zhuǎn)染細胞stathminmRNA的表達較對照組明顯減弱。結(jié)論特異性沉默stathmin基因的pSUPERS逆轉(zhuǎn)錄病毒載體以及穩(wěn)定表達的細胞系構(gòu)建和篩選成功。【關(guān)鍵詞】小干擾RNA；stathmin基因；pSUPEREGFP載體；Eca109細胞　　Abstract：ObjectiveToconstructandidentifyarebinantretroviralvect

3、orpSUPERSthattargetstathmingeneandastablevirusproducingcellline.MethodsThe64ntencodedtargetingstathmingeneshRNAsequenceedigestionandDNAsequencing.ThepackagingcellEca109idusingliposomebasedtransfectionandthestableintergrantedium.TheexpressionofstathminmRNAents,4692ntand285nt,resp

4、ectively.Theresultofsequencedemonstratedthat64nthadbeeninsertedintothevector.Greenfluorescentprotein（EGFP）ingeneingeneandastablevirusproducingpackagingcelllineallinterferingRNA;stathmingene;pSUPEREGFPvector;Eca109cells　　0引言　　食管癌是常見的惡性腫瘤之一。某些基因的異常表達與腫瘤發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。Stathmin為一種高度保守的細胞內(nèi)

5、蛋白，在多種惡性腫瘤細胞中高表達，研究表明[1,2]通過應(yīng)用反義核酸、單克隆抗體、核酶、stathmin蛋白抑制劑及絲氨酸位點突變體等方法封閉該基因表達，可使細胞受阻于G2／M期，同時使惡性腫瘤表型發(fā)生逆轉(zhuǎn)。stathmin成為惡性腫瘤生物治療的新靶點。RNA干擾是最新的基因敲除技術(shù)，具有高效性和特異性，能夠降解相應(yīng)的細胞內(nèi)mRNA，使基因轉(zhuǎn)錄后沉默[3]。本研究應(yīng)用含H1啟動子的逆轉(zhuǎn)錄載體pSUPEREGFP構(gòu)建了stathmin基因的siRNA表達載體pSUPERS，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染Eca109細胞，以特異性沉默目的基因的表達，觀察小干擾RNA（siRNA）

6、對靶基因表達的抑制作用，探討腫瘤基因治療的新模式?！　?材料與方法　　1.1材料　　1.1.1細胞系和質(zhì)粒人食管癌細胞Eca109、大腸桿菌JM109為鄭州大學腫瘤中心保存;pSUPEREGFP質(zhì)粒由鄭州大學基礎(chǔ)醫(yī)學院丁一教授惠贈，靶向stathmin的64ntoligos由上海生物工程公司合成。　　1.1.2試劑限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ、EcoRⅠ、HindⅢ、T4DNA連接酶和Trizol試劑購自Promega公司;DNAMarker、DNAPurificationkit和RTPCR檢測試劑盒購自大連寶信生物工程公司；脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染試劑Lipofecti

7、ne2000和G418購自美國Invitrogene公司?！　?.2方法　　1.2.1靶向stathmin基因寡核苷酸的設(shè)計應(yīng)用美國OligoEngine公司提供的雙鏈RNA（siRNA）設(shè)計軟件，選擇合適的19nt靶序列，通過Blast搜索確認與人的其他基因序列無同源性。該19nt的序列分別為：5′GAAAGACGCAAGTCCCATG3′，5′ACGAGAGCACGAGAAAGAA3′，由上海生物工程公司合成兩條64nt的互補單鏈，序列見表1?！　”?兩條64nt的互補單鏈序列（略）　　1.2.2載體的選擇選用pSUPEREGFP質(zhì)粒為載體，經(jīng)

8、BglⅡ和HindⅢ兩酶切后與合成的64nt的寡核苷