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1、阻斷Stathmin基因高表達對成骨肉瘤細胞系的【摘要】目的探討Stathmin基因的反義核酸（AS-ODN）對人成骨肉瘤細胞系的生長抑制作用。方法以高表達Stathmin的人成骨肉瘤細胞系SOSP-9607為靶細胞、反義Stathmin（AS-ODN）為阻斷劑，通過MTT試驗觀察AS-ODN對成骨肉瘤細胞的生長抑制作用，流式細胞儀分析細胞增殖周期的影響。結(jié)果AS-ODN能明顯抑制成骨肉瘤細胞的生長（P<0.05）.SOSP-9607在AS-ODN作用下，細胞分裂阻滯在分裂期的中期，并誘導細胞發(fā)生凋亡。結(jié)論Stat
2、hmin基因的反義核酸（AS-ODN）對成骨肉瘤細胞的生長可能起十分重要的作用，它有望成為成骨肉瘤治療的新靶點?！娟P鍵詞】Stathmin基因；反義核酸；成骨肉瘤細胞【Abstract】ObjectiveToinvestigatetheinhibitionofAS-ODNofStathmingeneonculturedhumanosteosaracelllines.Methodsetablastin）為一種高度保守的細胞內(nèi)蛋白。TT試驗（測定AS-ODN對SOSP-9607細胞生長的抑制作用）取對數(shù)生長期的SOSP-96
3、07細胞，調(diào)節(jié)細胞密度為5×104/ml，各取0.2ml加入96孔板中，分別標記正義組、反義組。正義組和反義組分別加入終濃度均為20μmol/L的S-ODN和AS-ODN。每組設3個復孔，培養(yǎng)后1、2、3、4進行臺盼藍染色細胞計數(shù)，計算生長抑制率［（對照組細胞數(shù)-處理組細胞數(shù)）/對照組細胞數(shù)］。1.2.2流式細胞儀分析流式細胞儀（FCM）分析采用Nicolletti氏法。將終濃度為20μmol/L的S-ODN和AS-ODN與SOSP-9607細胞共同培養(yǎng)3天后，離心，去培養(yǎng)液，DBS洗滌2次，0.2mlPBS重懸SOSP
4、-9607細胞，用吸管快速吹打進預冷的700mL/L乙醇中，4℃保存，檢測前離心去乙醇，碘化丙啶染色15min，上機檢測。所用流式細胞儀為EpicsElite（美國），汞激光激發(fā)波長為488nm。結(jié)果分析軟件為Elite4.0和DNAMultictycle。1.3統(tǒng)計學處理數(shù)據(jù)以x±s表示，差異顯著性采用t、χ2檢驗。2結(jié)果與正義組相比，反義組對SOSP-9607細胞生長具有明顯的抑制作用，差異有顯著性（P<0.05），見表1和圖1；反義組抑制率明顯高于正義組（P<0.05），見表2和圖2。表1不同時間藥物對
5、SOSP-9607細胞生長的影響（略）注：Vscontrol，P<0.05表2S-ODN、AS-ODN對SOSP-9607細胞生長抑制率的比較（略）細胞生長抑制率的比較細胞周期分布分析：AS-ODN（20μmol/L）處理細胞3h后，可見細胞G2/M期百分比增高；至48h，G2/M期百分比達55.5%。亞二倍體峰（Sub-G1）表示DNA降解，又稱細胞凋亡峰;在72h，Sub-G1期細胞占9.2%，提示細胞凋亡發(fā)生。見表3。S-ODN（20μmol/L）處理組未見出現(xiàn)亞二倍體峰。表3AS-ODN（20μmol/L）
6、處理SOSP-9607細胞不同時間的DNA含量分析（略）3討論反義基因療法是目前腫瘤基因治療中的一個重要方面，它是應用反義核酸在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平阻斷某些基因的異常表達，以其阻斷瘤細胞內(nèi)的異常傳導信號，使瘤細胞進入正常分化軌道或引起細胞凋亡［6］。成骨肉瘤是常見的惡性骨腫瘤，預后較差。目前對于成骨肉瘤的基礎研究及臨床治療仍是當今醫(yī)學領域熱點之一。研究表明，Stathmin是從淋巴瘤中篩選出的特征性的表達基因［7～9］，為一種高度保守的細胞內(nèi)蛋白，在細胞周期過程中可被蛋白激酶磷酸化，阻斷Stathmin磷酸化將使細胞分裂停止于
7、G2/M期［4］。細胞內(nèi)微管相關蛋白磷酸化過程中Stathmin是重要調(diào)節(jié)因子［10］，影響細胞分裂及增殖。筆者應用RT-PCR方法首次在成骨肉瘤細胞中檢測到Stathmin高表達（見圖3），在此基礎上利用反義核酸技術、抑制其表達，其活性被封閉后，SOSP-9607細胞的增殖出現(xiàn)障礙，說明Stathmin基因在維持SOSP-9607細胞的生長中起十分重要的作用。從表1、圖1和表2、圖2可看出，AS-ODN具有抑制SOSP-9607細胞生長的作用，而S-ODN無此作用。Lane1:PCRMarker；Lane2:K562細
8、胞為陽性對照；Lane3:人成骨肉瘤細胞系SOSP-9607細胞,可見480bp基因條帶。圖3RT-PCR檢測人成骨肉瘤細胞中Stathmin表達細胞周期分布分析，AS-ODN作用后首先表現(xiàn)為G2/M期的阻滯，在G1峰前出現(xiàn)凋亡小峰（AP峰）隨后G2/M逐漸減少，AP逐漸增多。AP峰的出現(xiàn)表明細胞DNA降解、滲漏，導
