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1、mBMP┐4真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá) 0引言 骨形態(tài)發(fā)生蛋白-4（BMP-4）具有誘導(dǎo)成骨潛能細(xì)胞向軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞方向分化并形成新骨的能力.隨著基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的應(yīng)用，將外源基因轉(zhuǎn)入靶細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)靶細(xì)胞表達(dá)外源基因而發(fā)揮作用成為可能.本研究的目的是通過(guò)基因克隆和DNA重組技術(shù)構(gòu)建可在真核細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的BMP-4表達(dá)載體，并觀測(cè)外源基因在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的情況，為探索將基因轉(zhuǎn)移技術(shù)應(yīng)用于骨折及骨不連等疾病的治療奠定一定的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ). 1材料和方法 1.1試劑 質(zhì)粒pcDNA3和pSPT-18-mBMP-4均由呂振華博士饋贈(zèng)，EcoRI和HindIII，T4DNA連
2、接酶、溴化乙錠（EB）、RNAase購(gòu)自華美公司，普通瓊脂糖、脂質(zhì)體（lipofec-tamin）、G418、DMEM購(gòu)自Gibco公司，胎牛血清購(gòu)自Hy-clone公司. 1.2儀器 CO2孵箱，CO2培養(yǎng)箱，低溫冷凍高速離心機(jī)，空氣恒溫?fù)u床，水平電泳儀，TanonGIS凝膠圖像處理系統(tǒng)等. 1.3真核表達(dá)載體pcDNA3-mBMP-4的構(gòu)建和鑒定 氯化鈣法將pSPT-18-mBMP-4質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞HB101，氨芐青霉素篩選后挑選陽(yáng)性菌落擴(kuò)增，小量提取mBMP-4質(zhì)粒并用EcoRI和HindIII消化，12g・L-1瓊脂糖電
3、泳，鑒定后回收1.3kbmBMP-4片段;采用相同的酶消化pcDNA3質(zhì)粒并回收5.3kb線狀質(zhì)粒片段;采用T4DNA連接酶定向克隆mBMP-4到真核表達(dá)載體pcDNA3中;將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌HB101中并大量擴(kuò)增、回收、純化;EcoRI和HindIII消化新構(gòu)建的質(zhì)粒，12g・L－1瓊脂糖凝膠電泳鑒定，使用λDNA/HindIIImarker，溴化乙錠顯色. 1.4真核表達(dá)載體pcDNA3-mBMP-4轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞及其表達(dá)的檢測(cè) 采用脂質(zhì)體（lipofectamine）轉(zhuǎn)染法將真核表達(dá)載體pcDNA3-mBMP-4轉(zhuǎn)入NIH
4、3T3細(xì)胞內(nèi)（本實(shí)驗(yàn)室凍存），G418（350μg・mL-1）篩選轉(zhuǎn)染陽(yáng)性細(xì)胞;同樣的方法轉(zhuǎn)染pcDNA3質(zhì)粒到NIH3T3細(xì)胞作為空白對(duì)照.打點(diǎn)雜交檢測(cè)mBMP-4在mRNA水平中的表達(dá). 2.2mBMP-4在NIH3T3細(xì)胞內(nèi)的表達(dá) 轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的NIH3T3細(xì)胞在G418篩選的早期表現(xiàn)為大量細(xì)胞死亡，僅少量陽(yáng)性細(xì)胞生存.陽(yáng)性細(xì)胞經(jīng)持續(xù)G418篩選和克隆化生長(zhǎng)，轉(zhuǎn)染后20d在培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)生長(zhǎng)到指數(shù)生長(zhǎng)期的末期;以后陽(yáng)性細(xì)胞均在G418篩選下培養(yǎng)，傳代培養(yǎng)7d后傳代，以后每代均為5～7d傳代一次.打點(diǎn)雜交顯示轉(zhuǎn)染真核表達(dá)載體的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞均為陽(yáng)
5、性，而轉(zhuǎn)染空白載體的對(duì)照組細(xì)胞為陰性. 3討論 基因轉(zhuǎn)染技術(shù)是將外源基因轉(zhuǎn)入細(xì)胞內(nèi)并使之在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)的技術(shù).早期主要是用來(lái)糾正某些遺傳性缺陷性疾病，通過(guò)將相關(guān)基因轉(zhuǎn)入缺陷動(dòng)物體內(nèi)并進(jìn)行表達(dá)來(lái)達(dá)到治療目的［1］.隨著基因轉(zhuǎn)染技術(shù)的發(fā)展，它已經(jīng)不僅用于彌補(bǔ)基因的缺陷，也可用來(lái)治療一些常規(guī)性疾病，如在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎治療中的探索性應(yīng)用［2］.BMP在治療骨折和促進(jìn)骨不連中具有獨(dú)特作用，其家族各成員基因序列已經(jīng)明確，因此，構(gòu)建它們的真核表達(dá)載體并轉(zhuǎn)入患者體細(xì)胞內(nèi)，通過(guò)在局部表達(dá)BMP并作用于成骨潛能細(xì)胞促進(jìn)骨折愈合成為可能，這將使骨折的治療變的更為簡(jiǎn)單. 基因治療的
6、關(guān)鍵步驟之一是真核表達(dá)載體的構(gòu)建和能否在細(xì)胞內(nèi)表達(dá).本實(shí)驗(yàn)中所使用的mBMP-4基因和質(zhì)粒pcDNA3中均含有EcoRI和HindIII酶切位點(diǎn)，因此通過(guò)定向克隆的方法將mBMP-4和質(zhì)粒pcDNA3連接，亞克隆成為真核表達(dá)載體pcDNA3-mBMP-4，通過(guò)將其轉(zhuǎn)染NIH3T3細(xì)胞證明其可在真核細(xì)胞內(nèi)成功表達(dá)，說(shuō)明該載體構(gòu)建成功.pcDNA3-mBMP-4真核表達(dá)載體的成功構(gòu)建，將為在分子水平研究BMP-4在骨折治療中的作用機(jī)制和BMP與其他因子間的相互作用原理奠定一定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，并為將來(lái)骨與關(guān)節(jié)的損傷的治療和骨與軟骨的組織工程的研究打下良好的基礎(chǔ).
