ddr2-fc融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)

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1、DDR2/Fc融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)【關(guān)鍵詞】,盤狀結(jié)構(gòu)域受體2；Fc；DS區(qū)域；融合表達(dá)　　【Abstract】AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorofDDR2FcfusiongeneandtoinvestigateitsexpressioninHEK293cells.METHODS:ThetplifiedbyPCRrespectivelyfromtheratbraintissueandtheplasmidcontainingthefulll

2、engthcDNAofhumanIgG1Fc,andclonedtotheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(-)bydirectionalcloning.TheresultantrebinantplamidpcDNA3.1(-)/DDR2Fcetransfectionreagent.ThenRTPCR,MPs)的表達(dá)水平上調(diào)［1-2］.DDR2在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,RA)患者滑膜中呈過表達(dá)狀態(tài)［3］,這些過度表達(dá)和活化的DDR2調(diào)節(jié)下

3、游信號通路產(chǎn)生大量MMPs,從而降解關(guān)節(jié)軟骨中的主要成分Ⅱ型膠原，最終進(jìn)一步破壞軟骨和骨［4］.因此，研究和制備Ⅱ型膠原DDR2MMPs這一信號通路的競爭性阻斷劑有重要意義.我們將DDR2中負(fù)責(zé)與Ⅱ型膠原結(jié)合的區(qū)域DSdomain［5］與IgG1Fc段融合起來在293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),使其具備有活性的二聚化狀態(tài)，為進(jìn)一步研究其競爭性阻斷劑功能奠定基礎(chǔ).　　1材料和方法　　1.1材料雄性SD大鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實驗動物中心）；293細(xì)胞、pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體、大腸桿菌XL10菌株(本室保存)；Li

4、pofectamine2000(Invitrogen公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；抗Fc抗體(第四軍醫(yī)大學(xué)免疫教研室惠贈)；D18T載體,T4DNA連接酶（TaKaRa公司）；質(zhì)粒提取和DNA回收試劑盒（安徽優(yōu)晶公司）.　　1.2方法　　1.2.1引物設(shè)計DDR2的DSdomain片段（命名為DS）的上游引物序列：5′TCTAGAGTCGACCTGAAATGATCCTGATTCCCAGAATG3′,其中TCTAGA序列為XbaⅠ酶切位點；DS的下游引物序列：5′GGTACCTCCACAACCA

5、TAAAGCTCGACCCTCATG3′,其中GGTACC序列為KpnⅠ酶切位點，TCC為額外引入的序列，將翻譯成2個片段之間的柔性氨基酸Gly.Fc段的上游引物序列：5′GAATTCGGTACCGGAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC3′,其中GAATTC序列為EcoRⅠ酶切位點，GGTACC序列為KpnⅠ酶切位點，GGAGGC為引入的序列，將翻譯成兩個片段之間的柔性氨基酸GlyGly；Fc段的下游引物序列：5′AAGCTTTCATTTACCCGGAGACAGGGAGAG3′,其中AA

6、GCTT序列為HindⅢ酶切位點，TCA為終止碼的反向互補序列.　　1.2.2模板制備及RNA反轉(zhuǎn)錄取大鼠腦組織0.1g，用Trizol法提取總RNA.取總RNA1μg加入oligo（dT）152μL，70℃溫育10min，再加入5×RTbuffer5μL，dNTP（10mmol/L）2.5μL，AMV1μL，補DEPC水至25μL，于42℃下反應(yīng)1h后95℃5min終止反應(yīng).　　1.2.3PCR擴增及產(chǎn)物修飾在200μL反應(yīng)體系中加入10×buffer20μL，dNTP（10mmol/L）4μL、上下游

7、引物（10μmol/L）各4μL、模板DNA(腦組織cDNA,Fc質(zhì)粒)各8μL,pfu4μL,Taq1.2μL，補水至200μL.PCR擴增條件為94℃5min，94℃1min，52℃1min，68℃2min，后3步進(jìn)行35個循環(huán),最后，68℃延伸10min.擴增產(chǎn)物回收后溶于30μLTrisHCl（pH8.0）中，并進(jìn)行加“A”反應(yīng).　　1.2.4PCR產(chǎn)物克隆及序列測定上述加“A”后的PCR產(chǎn)物回收后直接與pMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10后，挑選克隆進(jìn)行EcoRⅠ/HindⅢ酶切,鑒定片段

8、是否插入pMD18T載體中.將陽性克隆送公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中的基因序列進(jìn)行比對.　　1.2.5融合表達(dá)載體的建立和鑒定EcoRⅠ/HindⅢ酶切FcpMD18T,將Fc片段切下,插入pcDNA3.1(-)中,并用EcoRⅠ/HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定.再用XbaⅠ/KpnⅠ將DSpMD18T中的DS切下,連入同樣酶切過的FcpcDNA3.1(-),構(gòu)建成DS/FcpcDNA3.1(-),用XbaⅠ/KpnⅠ,Kp