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《ddr2-fc融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)論文》由會(huì)員上傳分享，免費(fèi)在線閱讀，更多相關(guān)內(nèi)容在工程資料-天天文庫。
1、DDR2/Fc融合基因真核表達(dá)載體的構(gòu)建及表達(dá)論文張燕王保莉蘇金車紅磊于江天劉新平【關(guān)鍵詞】,盤狀結(jié)構(gòu)域受體2；Fc；DS區(qū)域；融合表達(dá)【Abstract】AIM:ToconstructtheeukaryoticexpressionvectorofDDR2FcfusiongeneandtoinvestigateitsexpressioninHEK293cells.METHODS:ThetplifiedbyPCRrespectivelyfromtheratbraintissueandtheplasmidcontainingthefulllengthcDNAofhum
2、anIgG1Fc,andclonedtotheeukaryoticexpressionvectorpcDNA3.1(-)bydirectionalcloning.TheresultantrebinantplamidpcDNA3.1(-)/DDR2Fcetransfectionreagent.ThenRTPCR,MPs)的表達(dá)水平上調(diào)［1-2］.DDR2在類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(rheumatoidarthritis,.freelain［5］與IgG1Fc段融合起來在293細(xì)胞中進(jìn)行表達(dá),使其具備有活性的二聚化狀態(tài)，為進(jìn)一步研究其競爭性阻斷劑功能奠定基礎(chǔ).1材料和方法1.1
3、材料雄性SD大鼠（第四軍醫(yī)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）；293細(xì)胞、pcDNA3.1(-)真核表達(dá)載體、大腸桿菌XL10菌株(本室保存)；Lipofectamine2000(Invitrogen公司)；DMEM培養(yǎng)基(Gibco公司)；抗Fc抗體(第四軍醫(yī)大學(xué)免疫教研室惠贈(zèng))；D18T載體,T4DNA連接酶（TaKaRa公司）；質(zhì)粒提取和DNA回收試劑盒（安徽優(yōu)晶公司）.1.2方法1.2.1引物設(shè)計(jì)DDR2的DSdomain片段（命名為DS）的上游引物序列：5′TCTAGAGTCGACCTGAAATGATCCTGATTCCCAGAATG3′,其中TCTAGA序列為XbaⅠ酶
4、切位點(diǎn)；DS的下游引物序列：5′GGTACCTCCACAACCATAAAGCTCGACCCTCATG3′,其中GGTACC序列為KpnⅠ酶切位點(diǎn)，TCC為額外引入的序列，將翻譯成2個(gè)片段之間的柔性氨基酸Gly.Fc段的上游引物序列：5′GAATTCGGTACCGGAGGCGAGCCCAAATCTTGTGACAAAAC3′,其中GAATTC序列為EcoRⅠ酶切位點(diǎn).freelin，再加入5×RTbuffer5μL，dNTP（10mmol/L）2.5μL，AMV1μL，補(bǔ)DEPC水至25μL，于42℃下反應(yīng)1h后95℃5min終止反應(yīng).1.2.3PCR擴(kuò)增及產(chǎn)物修飾在
5、200μL反應(yīng)體系中加入10×buffer20μL，dNTP（10mmol/L）4μL、上下游引物（10μmol/L）各4μL、模板DNA(腦組織cDNA,Fc質(zhì)粒)各8μL,pfu4μL,Taq1.2μL，補(bǔ)水至200μL.PCR擴(kuò)增條件為94℃5min，94℃1min，52℃1min，68℃2min，后3步進(jìn)行35個(gè)循環(huán),最后，68℃延伸10min.擴(kuò)增產(chǎn)物回收后溶于30μLTrisHCl（pH8.0）中，并進(jìn)行加“A”反應(yīng).1.2.4PCR產(chǎn)物克隆及序列測定上述加“A”后的PCR產(chǎn)物回收后直接與pMD18T載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌XL10后，挑選克隆進(jìn)行Eco
6、RⅠ/HindⅢ酶切,鑒定片段是否插入pMD18T載體中.將陽性克隆送公司測序，將測序結(jié)果與GenBank中的基因序列進(jìn)行比對(duì).1.2.5融合表達(dá)載體的建立和鑒定EcoRⅠ/HindⅢ酶切FcpMD18T,將Fc片段切下,插入pcDNA3.1(-)中,并用EcoRⅠ/HindⅢ進(jìn)行酶切鑒定.再用XbaⅠ/KpnⅠ將DSpMD18T中的DS切下,連入同樣酶切過的FcpcDNA3.1(-),構(gòu)建成DS/FcpcDNA3.1(-),用XbaⅠ/KpnⅠ,KpnⅠ/HindⅢ,EcoRⅠ/HindⅢ分別進(jìn)行酶切鑒定.1.2.6HEK293細(xì)胞的培養(yǎng)及質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染HEK29
7、3細(xì)胞用含有100mL/L小牛血清的DMEM培養(yǎng)，轉(zhuǎn)染前24h傳代，接種入6孔板中.待轉(zhuǎn)染細(xì)胞共分3組,分別是DS/FcpcDNA3.1(-)組、空載體pcDNA3.1(-)組和空對(duì)照組.當(dāng)細(xì)胞長至80％時(shí)轉(zhuǎn)染：將10μLLipofectamine2000與4μg待轉(zhuǎn)染質(zhì)粒混合，室溫靜置20min后用于孵育細(xì)胞,培養(yǎng)16h后換無血清的DMEM培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)48h,收獲細(xì)胞.1.2.7細(xì)胞總RNA的提取及RTPCR檢測mRNA的表達(dá)收獲細(xì)胞,一部分用Trizol提取細(xì)胞總RNA,AMV進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄,以DS上游引物和Fc下游引物進(jìn)行DDR2/Fc的擴(kuò)增，同時(shí)設(shè)立GAPD
8、H為內(nèi)參照
